Levande cellen fluorescensmikroskopi för att iaktta nödvändiga processer under mikrobiell celltillväxt

Summary

Svårt att förstå funktionen av viktiga processer i bakterier. Fluorescensmikroskopi med målet-specifika färgämnen kan ge viktiga insikter i mikrobiell cell tillväxt och cellcykeln progression. Här används Agrobacterium tumefaciens som en modell bakterie att lyfta fram metoder för levande cell avbildning för karaktärisering av väsentliga processer.

Abstract

Cellulära kärnprocesser såsom DNA-replikation och segregering, proteinsyntes, växtcellväggar och celldelning är beroende av funktionen av proteiner som är avgörande för bakteriell överlevnad. En rad mål-specifika färgämnen kan användas som sonder för att bättre förstå dessa processer. Färgning med lipofila färgämnen möjliggör observation av membranstruktur, visualisering av lipid microdomains, och upptäckt av membran blebs. Användning av lysrör-d-aminosyror (FDAAs) sond platserna för biosyntesen av peptidoglykan kan indikera potentiella defekter i cellväggen biogenes eller cell tillväxt mönster. Slutligen, nukleinsyra fläckar kan indikera eventuella defekter i DNA-replikering eller kromosom segregation. Cyanin DNA fläckar etikett levande celler och är lämpliga för time-lapse mikroskopi möjliggör realtid observationer av nucleoid morfologi under celltillväxt. Protokoll för cell märkning kan tillämpas på protein utarmning mutanter att identifiera defekter i membranstruktur, cellväggen biogenes eller kromosomsegregering. Time-lapse mikroskopi kan dessutom användas för att övervaka morfologiska förändringar som en viktig protein tas bort och kan ge ytterligare insikter om proteinfunktion. Till exempel resulterar utarmning av väsentliga celldelning proteiner i filamentation eller förgrening, medan utarmning av cell tillväxt proteiner kan orsaka celler att bli rundare eller kortare. Här finns protokoll för celltillväxt, target-specifik märkning och time-lapse mikroskopi för bakteriell växt patogen Agrobacterium tumefaciens. Tillsammans, target-specifika färgämnen och time-lapse mikroskopi aktivera karakterisering av viktiga processer i A. tumefaciens. Slutligen kan de protokoll som tillhandahålls lätt ändras sond väsentliga processer i andra bakterier.

Introduction

Progression genom bakteriell cellcykeln kräver samordning av många processer inklusive membran och cellväggen biosyntes, DNA-replikation och segregation och celldelning. För att fullt förstå komplexiteten av bakteriell cellbiologi, är det nödvändigt att studera dessa väsentliga händelser; dock är detta en icke-trivial uppgift eftersom cellernas viabilitet äventyras när viktiga komponenter i dessa vägar är mutagenized. Epifluorescence mikroskopi tillsammans med target-specifika färgämnen är en kraftfull metod att söka dessa viktiga processer i vildtyp och muterade bakteriestammar.

Peptidoglykan-specifika färgämnen inkluderar fluorescerande antibiotika (vancomycin-FL, bocillin-FL) och lysrör-d-aminosyror (till exempel 7-hydroxycoumarin-3-karboxylsyror syra-3-amino-d-alanin, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanin , NADA; tetrametylrodamin-3-amino-d-alanin; TADA). I grampositiva bakterier, har användandet av subletala koncentrationer av fluorescerande antibiotika analoger sond platser av peptidoglykan biosyntes varit en effektiv strategi att avslöja peptidoglykan införande mönster^{1,2, 3,4}. Medan fluorescerande vankomycin märkning har använts för att få insikter i peptidoglykan införande mönster i fasta gramnegativa bakterier⁵, ger det yttre membranet i allmänhet en permeabilitet barriär som hindrar användning av fluorescerande antibiotika som en sond för peptidoglykan biosyntes i levande celler. Däremot etikett korta pulser av lysrör-d-aminosyror eller d-aminosyror med biorthogonal funktionella grupper kovalent regioner i senaste peptidoglykan införande i ett brett utbud av levande bakterieceller^6,7. Mönster av peptidoglykan införande som har observerats med syntetisk d-aminosyror inkluderar punktuell och septal (Escherichia coli och Bacillus subtilis), polar och septal (Agrobacterium tumefaciens och Listeria monocytogenes), septal bara (Staphylococcus aureus), och apikala (Streptomyces venezuelae)^6,7. Dessa observationer tyder på att bakterier uppvisar varierande mönster av cellväggen biogenes och att användningen av syntetiskt d-aminosyror som sonder för att pröva tillväxt mönster är en värdefull strategi i många bakterier.

Färgämnen som etikett bakteriell kromosomer inkluderar deoxiribonukleinsyra (DNA) specifika mindre groove bindemedlet (4,6-diamidin-2-fenylindol; DAPI) och hög affinitet cyanin färgämnen (grön och Orange; se material lista). DAPI färgning av fasta celler hjälper uppräkning av bakterier från miljöprover⁸, medan DAPI färgning av levande celler används för att indikera bakteriell livskraft⁹. Däremot färgämnen cyanin som Orange och grönt är ofta beskrivs som membran impermeant ”döda” cell fläckar att räkna upp icke-viabla celler⁹. Anmärkningsvärt, när reagenserna används sond av den bakteriella nucleoid morfologi under celltillväxt, DAPI, Orange och grön alla visade sig vara membran diffusionskoefficient och kapabla att märkning levande celler¹⁰. I levande E. coli celler, DAPI färgning av DNA visas diffusa på grund av auto-fluorescens från cytoplasman och upprepad exponering av DAPI-färgade celler för ultraviolett (UV) ljus perturbs nucleoid struktur¹⁰. Färgning E. coli eller B. subtilis med Orange avslöjar att detta färgämne är membran diffusionskoefficient och ger långvarig fluorescens vid bindning till DNA i levande celler utan att påverka celltillväxt, DNA-replikation eller kromosomsegregering¹⁰ . Dessa observationer tyder på att cyanin DNA färgämnen kan användas för att övervaka morfologi av nucleoids under celltillväxt i många bakterier.

Phospholipid-Specific stryl färgämnen såsom N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenyl) hexatrienyl) deoxypyri etylenedibromid (4-64; se material lista) är katjoniska föreningar och associera företrädesvis med negativt laddade fosfolipider såsom kardiolipin och phosphatidylglycerol¹¹. Distinkta mönster observeras när 4-64 används för att märka membranet i olika bakterier. I Escherichia coli, 4-64 anrikas i polerna, i band längs laterala väggen, och i de division platserna sen pre-divisional celler¹². I Bacillus subtilismöjliggör 4-64 märkning visualisering av lipid spiraler¹³. I Agrobacterium tumefaciens, 4-64 etiketter det yttre membranet och observeras i en karakteristisk ”hästskon” mönster där tillväxt masten saknar märkning^14,15. Dessa observationer tyder på att dessa bakterier uppvisar heterogena lipid investeringsperiodens förekomsten av lipid domäner som bidrar till cellulära asymmetri. Förändringar i 4-64 märkning mönster som förekomsten av diffusa märkning, blebs eller blåsor, invaginations eller membran krympning kan vara informativ i kännetecknar mutanter som påverkar distribution eller biosyntesen av lipider.

Bortom färgning celler, är det nödvändigt att fastställa funktionen av proteiner deltar i viktiga processer. Karakterisering av viktiga proteiner är tekniskt utmanande eftersom det inte går att ta bort viktiga gener och studera de fenotypiska konsekvenserna. Således, alternativa metoder som bryter ned proteinet har dykt upp. Exempelvis kan en viktig gen sättas under kontroll av en inducerbara arrangören i stället för dess infödda tillskyndare. Inducerbara initiativtagare är lyhörda för små molekyler såsom; zink¹⁶, isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)^{17,18,19,20,21}, arabinos²², vanillate^17,23, och xylos²³, därmed transkriptionen av målgenen upphör och proteinet av intresse är förbrukad när induceraren tas bort. Alternativa metoder för nedbrytande viktiga proteiner av intresse inkluderar syntetiska riboswitches²⁴ som använder liten molekyl-RNA interaktioner hindrar transkription av målgener, CRISPR störningar^25,26 till block transkription av målgener och inducerbara protein nedbrytning^27,28 som använder peptid taggar till målprotein för nedbrytning av de ClpXP-proteashämmaren. Utarmning stammar ger endast en kort tid för karakterisering innan cellerna förlorar bärkraft, mikroskopbilder av celler med tiden under protein utarmning är därför en kraftfull metod för karakterisering. Mikroskopi av levande bakterieceller har faktiskt gjort det möjligt för forskare att få insikter i grundläggande biologiska processer, inklusive mekanismer för cell form underhåll, sekretion och uppdelning²⁹.

A. tumefaciens är en bakteriell växt patogen³⁰ och naturliga genetiska ingenjör^31,32. Således, mekanismer relaterade till patogenicitet, inklusive värd-patogen interaktioner^33,34,35, sekretion³⁶och värd omvandling^{30,31, 37} har studerats i större omfattning. För att designa strategier som hindrar A. tumefaciens medierad sjukdom eller förbättra växt förvandling, måste processerna som är avgörande för A. tumefaciens överlevnad förstås bättre. Användningen av target-specifika färgämnen och den senaste utvecklingen av ett protein utarmning strategi för A. tumefaciens¹⁸ ger en möjlighet att undersöka väsentliga processer.

Här finns detaljerade protokoll för Mikroskopisk analys av vildtyp och mutant protein utarmning stammar av A. tumefaciens . De två första protokoll beskriva hur man förbereder celler och märka dem med målet-specifika färgämnen. Det tredje protokollet innehåller stegvisa anvisningar för att förbereda agaros pads (figur 1) och imaging bakteriecellerna (figur 2, figur 3, figur 4). Dessa protokoll kan också vara lämplig för andra bakterier med ytterligare anpassningar för olika medier villkor, tillväxttakt, krav på syrgasutrustning och cellstrukturer.

Protocol

1. tillväxt av A. tumefaciens stammar Odling A. tumefaciens stammar Använd en steril trä pinne eller Pipettera spets för att Inokulera 1 mL ATGN tillväxt medier (se lista över material för receptet) med en enda koloni av önskad stammen.Obs: För A. tumefaciens utarmning stammar, ATGN bör innehålla 1 mM IPTG som en inducerare att upprätthålla biosyntes av proteinet viktigt. Växa de A. tumefaciens stammarna övernattning i…

Representative Results

Target-specifik märkning av vildtyp A. tumefaciens cellerFör att illustrera att cellmorfologi påverkas inte av tvätta stegen eller behandling med 1% DMSO (som används för att späda ut de fluorescerande färgerna), celler var avbildas direkt från kultur (figur 2A, längst till vänster panel), efter tvättning cellerna av centrifugering som beskrivs i punkt 1.2 (figur…

Discussion

Detta protokoll innehåller en rad förfaranden för undersökning av A. tumefaciens vildtyp, mutant och utarmning stammar. Det är värt att notera att alla förfaranden i avsnittet protokoll kan lätt anpassas för andra bakteriestammar med ytterligare ändringar att redovisa tillväxt medier, temperaturer och tillväxttakt.

Användningen av target-specifika färgämnen är ett värdefullt verktyg för att tillhandahålla en detaljerad karakterisering av cellcykeln händelser i bakt…

Materials

Bacterial Strains
Agrobacterium tumefaciens C58	ATCC	33970	Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA			Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Components
ATGN Minimal Medium			To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.
20X AT Buffer			Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.
NaOH	Fisher BioReagents	BP359
KH2PO4	Fisher Chemical	P288
20X AT Salts			Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave.
(NH4)2SO4	Fisher Chemical	A701
MgSO4•7H2O	Fisher BioReagents	BP213
CaCl2•2H2O	Fisher BioReagents	BP510
MnSO4•H2O	Fisher Chemical	M114
Glucose	Fisher Chemical	D16	Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.
Bacto Agar	Fisher BioReagents	BP1423	Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Optional Media Additives
Kanamycin	GoldBio	K-120	Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml.
IPTG	GoldBio	I2481C5	Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopy Materials
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550D	25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-541-B	22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.
Sparkle Glass Cleaner	Home Depot	203261385	Ammonia and alcohol free.
Ultra Pure Agarose	Invitrogen	16500-100	Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 – 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C
PBS	Fisher BioReagents	BP399500	10X solution to be diluted to 1X with sterile water.
Parafilm	Bemis	PM-999	Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.
VALAP			Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.
Lanolin Butter	SAAQIN	SQ-LAB-R1
Petroleum Jelly	Target Corp.	06-17644
Paraffin Wax	Crafty Candles	263012
Name	Company	Catalog Number	Comments
Target-specific dyes
DMSO	Fisher BioReagents	BP231-1	Use to dilute stock solutions of dyes as needed.
FDAAs (NADA, HADA,TADA)			FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml.
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S11368	Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM.
FM4-64	Invitrogen	T3166	Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dry bath	Sheldon Manufacturing, Inc.	52120-200
Metallic thermal beads	Lab Armor	42370-002
Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera			Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.