Kombinere mitotiske celle synkronisering og høj opløsning Konfokal mikroskopi for at studere rollen af multifunktionelle cellecyklus proteiner under mitosen
Summary
Vi præsenterer en protokol for dobbelt thymidine synkronisering af HeLa celler efterfulgt af analyse ved hjælp af høj opløsning Konfokal mikroskopi. Denne metode er nøglen til at opnå store antal celler, der Fortsæt synkront fra S fase til mitose, muliggør undersøgelser på mitotiske roller af multifunktionelle proteiner, som også besidder interphase funktioner.
Abstract
Undersøgelse af de forskellige administrative begivenheder i cellecyklus i en fase-afhængige måde giver en klar forståelse for cellevækst og division. Synkronisering af cellepopulationer i bestemte faser af cellecyklus har vist sig for at være meget nyttigt i sådanne eksperimentelle bestræbelser. Synkronisering af celler ved behandling med kemikalier, som er relativt mindre giftige kan være fordelagtigt over anvendelsen af farmakologiske hæmmende stoffer til studiet af deraf følgende cellecyklus begivenheder og at opnå specifikke berigelse af valgte mitotiske faser. Her beskriver vi protokollen for synkronisering menneskelige celler på forskellige stadier af cellen cyklus, herunder både i S og M-fase med en dobbelt thymidine blok og frigive procedure for at undersøge funktionaliteten af mitotiske proteiner i kromosom justering og adskillelse. Denne protokol har været yderst nyttigt for at studere de mitotiske roller af multifunktionelle proteiner, som besidder etablerede interphase funktioner. I vores tilfælde, kan Cdt1, et protein, der er kritiske for replikering oprindelse licensering i G1 fase, mitotiske rolle studeres effektivt kun når G2/M-specifik Cdt1 kan være udtømt. Vi beskriver detaljerede protokollen for udtømning af G2/M-specifikke Cdt1 ved hjælp af dobbelt thymidine synkronisering. Vi forklare protokollen af celle fiksering og live celle imaging ved hjælp af høj opløsning Konfokal mikroskopi efter thymidine udgivelse. Metoden er også nyttige til at analysere funktionen af mitotiske proteiner på både fysiologiske og foruroliget betingelser som for Hec1, en komponent af Ndc80 kompleks, da det giver en til få store stikprøvestørrelser mitotiske celler for faste og levende celle analyse som vi viser her.
Introduction
I cellecyklus undergår celler en række stærkt reguleret og tidsligt kontrolleret begivenheder for den præcise overlapning af deres genom og spredning. I pattedyr består celle cyklus af interphase og M-fase. I interfase, som består af tre faser – G1, S, og G2, cellen dubletter, dets genom og gennemgår vækst, der er nødvendige for normale cellecyklus progression1,2. I M-fase, som består af mitose (prophase, prometaphase, metafase, anaphase og telophase) og cytokinesis, producerer en parental celle to genetisk identiske datterceller. I mitosen, Søster kromatider af duplikerede genom er kondenseret (prophase) og er fanget i deres kinetochores af mikrotubuli af samlet mitotiske spindel (prometaphase), der drev deres justering på metafase plade (metafase) efterfulgt af deres lig adskillelse, da Søster kromatider er delt mod og transporteres til modsatte spindel poler (anaphase). De to datterceller er fysisk adskilt af aktiviteten af en actin-baserede kontraktile ring (telophase og cytokinesis). Kinetochore er en specialiseret proteinholdige struktur, der samler på det centromeric område af kromatider og tjene som vedhæftede fil sites for spindel mikrotubuli. Dets vigtigste funktion er at køre kromosom capture, tilpasning, og støtte i rette forkert spindel mikrotubulus udlæg, mens mægle spindel forsamling checkpoint for at opretholde troskab af kromosom segregation3,4.
Teknikken med celle synkronisering tjener som et ideelt værktøj til at forstå de molekylære og strukturelle begivenheder, der er involveret i celle cyklus progression. Denne tilgang har været brugt til at berige cellepopulationer på specifikke faser for forskellige typer af analyser, herunder profilering af genekspression, analyser af cellulære biokemiske processer og påvisning af subcellulært lokalisering af proteiner. Synkroniseret pattedyrceller kan bruges ikke kun til undersøgelsen af individuelle genprodukter, men også for tilgange, der inddrager analyse af hele genomer herunder microarray analyse af gen expression5, miRNA udtryk mønstre6, Translationel regel7, og proteom analyse af protein ændringer8. Synkronisering kan også bruges til at studere effekterne af genekspression eller protein knock-down eller knock-out, eller kemikalier på cellecyklus progression.
Celler kan synkroniseres på de forskellige stadier af cellecyklus. Både fysiske og kemiske metoder er almindeligt brugt til celle synkronisering. De vigtigste kriterier for celle synkronisering er, at synkronisering skal være noncytotoxic og reversible. På grund af de potentielle negative cellulære konsekvenser af synkronisering af celler af farmakologiske midler, kan kemisk-dependent metoder være en fordel for at studere centrale cellecyklus begivenheder. For eksempel hydroxyurea, amphidicolin, mimosine og lovastatin, kan bruges til celle synkronisering på G1/S fase, men på grund af deres indvirkning på de biokemiske veje de hæmmer de aktivere cellecyklus checkpoint mekanismer og dræbe et vigtigt brøkdel af celler9,10. På den anden side kan feedback hæmning af DNA-replikation ved at føje thymidine til vækst medier, kendt som “thymidine blok”, arrestere cellecyklus på visse punkter11,12,13. Celler kan også synkroniseres på G2/M fase ved at behandle med nocodazole og RO-33069,14. Nocodazole, som forhindrer mikrotubulus forsamling, har en relativt høj cytotoksicitet. Desuden nocodazole-anholdt celler kan vende tilbage til interphase precociously af mitotiske skred. Dobbelt thymidine blok anholdelse på G1/S fase og efter løsladelse fra blokken celler findes celler, fortsætte synkront gennem G2 og i mitosen. Den normale progression af cellecyklus for cellerne frigives fra thymidine blok kan overholdes under høj opløsning Konfokal mikroskopi af enten celle fiksation eller live imaging. Effekten af undertrykkelse af netbårne mitotiske proteiner kan studeres, specielt når celler ind og fortsætte gennem mitosen efter løsladelse fra dobbelt thymidine blok. Cdt1, en multifunktionel protein, er involveret i DNA replikation oprindelse licenser i G1-fase og er også nødvendig for kinetochore mikrotubulus vedhæftede filer under mitosen15. For at studere funktionen af Cdt1 under mitosen, skal man anvende en metode, der undgår effekten af sin udtynding på replikering licenser i G1 fase, samtidig med at den foretager sine udtynding specifikt under G2/M fase kun. Vi præsenterer her, detaljerede protokoller baseret på dobbelt thymidine blok til at studere proteiner udfører flere funktioner i forskellige faser af cellecyklus mitotiske rolle af både faste og live-celle billeddannelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mest kritiske fordel af dobbelt thymidine synkronisering er at det giver en øget stikprøvestørrelse mitotiske celler i en kort tidsvindue med mange af disse celler ind i mitosen i fællesskab, således at også analyser af kromosom justering, bipolar spindel dannelse og kromosom adskillelse med meget højere effektivitet.
Mange regulerende proteinkomplekser og signalering veje er helliget sikre normal progression gennem mitosen og deregulering af denne proces kan førte til tumordannels…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for Dr. Kozo Tanaka Tohoku Universitet, Japan for at dele HeLa celler stabilt udtrykker mCherry-Histon H2B og normal god landbrugspraksis-α-tubulin. Dette arbejde blev støttet af en NCI tilskud til DV (R00CA178188) og af start-up midler fra Northwestern University.
Materials
| DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 degree C |
| DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 degree C |
| Leibovitz’s (1X) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 degree C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 degree C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 degree C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35MM Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
References
- Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
- Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
- Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).
- Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6 (1), E5 (2017).
- Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).
- Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).
- Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).
- Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).
- Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).
- Amon, A. Synchronization procedures. Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).
- Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).
- Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
- Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
- Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).
- Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).
- Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).
- Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
- Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12 (4), e0174819 (2017).
- Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).
- Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).
