Combinando células mitóticas sincronização e microscopia Confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas Multifunctional ciclo celular durante a mitose
Summary
Apresentamos um protocolo para sincronização de timidina duplo de células HeLa, seguido de análise utilizando microscopia confocal de alta resolução. Esse método é a chave para a obtenção de grande número de células que proseguem sincronicamente de fase S de mitose, permitindo estudos sobre funções mitóticas das proteínas multifunctional que também possuem funções de interfase.
Abstract
Estudo dos vários eventos reguladoras do ciclo celular de uma forma dependente da fase fornece um entendimento claro sobre o crescimento celular e divisão. A sincronização de populações de células em estágios específicos do ciclo celular foi encontrada para ser muito útil em tais esforços experimentais. Sincronização de células por tratamento com produtos químicos que são relativamente menos tóxicos pode ser vantajosa sobre o uso de drogas inibidoras farmacológicas para o estudo de eventos consequente ciclo celular e obter enriquecimento específico das fases mitóticas selecionados. Aqui, descrevemos o protocolo para Sincronizando pilhas humanas em diferentes fases da célula o ciclo, incluindo ambos na fase S e fase de M com um bloco de timidina duplo e liberar o procedimento para estudar a funcionalidade das proteínas mitóticas em alinhamento de cromossomo e segregação. Este protocolo tem sido extremamente útil para estudar as funções mitóticas das proteínas multifunctional que possuem funções de interfase estabelecida. No nosso caso, o papel mitótico da Cdt1, uma proteína essencial para o licenciamento de origem de replicação na fase G1, pode ser estudado efetivamente somente quando Cdt1 G2/M-específico pode ser esgotado. Descrevemos o protocolo detalhado para esgotamento de Cdt1 G2/M-específicos usando a sincronização de timidina duplo. Nós também explicar o protocolo de fixação da pilha e viver a imagem latente da pilha usando microscopia confocal de alta resolução após lançamento de timidina. O método também é útil para analisar a função das proteínas mitóticas em condições fisiológicas e perturbadas como para Hec1, um componente do complexo, o Ndc80, que permite um para obter os tamanhos de amostra grande de células mitóticas para celular fixo e ao vivo análise como mostramos aqui.
Introduction
No ciclo celular, as células sofrem uma série de eventos altamente regulamentados e temporalmente controlados para a duplicação exata do seu genoma e proliferação. Nos mamíferos, o ciclo celular consiste em interfase e fase M. Na interfase, que consiste em três fases – G1, S, e G2, a célula duplica seu genoma e sofre o crescimento que é necessário para o ciclo celular normal progressão1,2. Na fase M, que consiste de mitose (prófase, prometafase, metáfase, anáfase e telófase) e citocinese, uma célula parental produz duas células-filhas geneticamente idênticas. Em mitose, irmã cromátides irmãs de duplicação do genoma são condensado (prófase) e são capturados em seus cinetócoros por microtúbulos do fuso mitótico montado (prometafase), que dirige o seu alinhamento na placa metafásica (metáfase) seguida por seus igual a segregação quando irmã cromátides irmãs são divididos em direção e transportados para eixo oposto polos (anáfase). As duas células-filhas são fisicamente separadas pela atividade de um anel contrátil actina-baseado (telófase e citocinese). O cinetócoro é uma estrutura especializada proteicas que monta na região centromérica de cromátides irmãs e servem como locais de fixação para os microtúbulos do fuso. Sua principal função é conduzir a captura do cromossomo, alinhamento, e ajuda na correção de acessório do microtubule imprópria do eixo, enquanto mediando o checkpoint de montagem do eixo para manter a fidelidade do cromossoma segregação3,4.
A técnica de sincronização do celular serve como uma ferramenta ideal para compreender os eventos moleculares e estruturais envolvidos na progressão do ciclo celular. Esta abordagem tem sido usada para enriquecer as populações de células em fases específicas para vários tipos de análises, incluindo a criação de perfil de expressão gênica, análises de processos bioquímicos celulares e detecção de Localização subcellular das proteínas. Células de mamíferos sincronizadas podem ser usadas não só para o estudo de produtos de genes individuais, mas também para abordagens envolvendo análise de genomas inteira, incluindo análise de microarray de gene expressão5, miRNA expressão padrões6, Regulamento de translação7e análise proteômica de proteína modificações8. Sincronização também pode ser usada para estudar os efeitos da expressão do gene ou a proteína knock-down ou mata-mata, ou de produtos químicos na progressão do ciclo celular.
As células podem ser sincronizadas em diferentes fases do ciclo celular. Métodos físicos e químicos são amplamente utilizados para sincronização do celular. Os critérios mais importantes para a sincronização de célula são que a sincronização deve ser fotoefeito e reversível. Devido as potenciais consequências celulares adversas de Sincronizando pilhas por agentes farmacológicos, métodos químico-dependente podem ser vantajosos para estudar eventos chave ciclo celular. Por exemplo, Hidroxiureia, amphidicolin, mimosine e lovastatina, podem ser usados para sincronização de célula na fase G1/S, mas, por causa de seu efeito sobre as vias bioquímicas que eles inibem, eles ativar mecanismos de ponto de verificação do ciclo celular e matar um importante fração das células9,10. Por outro lado, feedback inibição da replicação do DNA pela adição de timidina para a mídia de crescimento, conhecida como “bloco” de timidina, pode prender o ciclo celular em certos pontos11,12,13. As células também podem ser sincronizadas na fase G2/M, tratando com nocodazole e RO-33069,14. Nocodazole, que impede a montagem de microtúbulos, tem uma relativamente elevada citotoxicidade. Além disso, as células nocodazole-preso podem retornar para interphase precocemente por deslizamento mitótico. Dupla timidina bloco prisão células na fase G1/S e após o lançamento do bloco, as células encontram-se proceder de forma síncrona G2 e mitose. A normal progressão do ciclo celular por células liberado do bloco de timidina pode ser observada sob microscopia confocal de alta resolução por fixação da pilha ou imagens ao vivo. O efeito da perturbação das proteínas mitóticas pode ser estudado especificamente quando células entram e prosseguir através de mitose, após o lançamento do bloco de timidina duplo. Cdt1, uma proteína multifuncional, está envolvido em licenciamento de origem de replicação do DNA na fase G1 e também é necessária para anexos do microtubule cinetócoro durante a mitose15. Para estudar a função de Cdt1 durante a mitose, é necessário adoptar um método que evita o efeito de sua redução na replicação de licenciamento durante a fase G1, enquanto ao mesmo tempo efetuar sua redução especificamente na fase G2/M apenas. Aqui, apresentamos protocolos detalhados baseados no bloco de timidina duplo para estudar o papel mitótico das proteínas executar múltiplas funções durante as diferentes fases do ciclo celular de imagens fixas e viver-pilha.
Protocol
Representative Results
Discussion
A vantagem mais crítica da sincronização de timidina duplo é que fornece um tamanho de amostra maior das células mitóticas em uma janela de tempo curto com muitas dessas células entrando em mitose em uníssono, permitindo assim também análises de alinhamento de cromossomo, bipolar eixo de formação e de segregação de cromossomas com eficiência muito maior.
Muitos complexos de proteína reguladora e vias de sinalização dedicam-se a garantir a progressão normal através de mitose…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Kozo Tanaka, da Universidade de Tohoku, Japão por compartilhar as células HeLa estàvel expressando mCherry-histona H2B e GFP-α-tubulina. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa NCI para DV (R00CA178188) e por fundos de start-up da Universidade de Northwestern.
Materials
| DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 degree C |
| DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 degree C |
| Leibovitz’s (1X) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 degree C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 degree C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 degree C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35MM Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
References
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