Combina la sincronización celular mitótica y microscopia Confocal de alta resolución para estudiar el papel de las proteínas multifuncional ciclo celular durante la Mitosis
Summary
Presentamos un protocolo para sincronización de timidina doble de células HeLa, seguido por el análisis mediante microscopía confocal de alta resolución. Este método es clave para la obtención de gran número de células que proceden síncrono de fase S de la mitosis, lo que permite estudios sobre roles mitotic de proteínas multifuncionales que también poseen las funciones de interfase.
Abstract
Estudio de los distintos eventos de regulación del ciclo celular en una forma dependiente de la fase proporciona una comprensión clara acerca de la división y crecimiento celular. La sincronización de poblaciones celulares en etapas específicas del ciclo celular ha resultado para ser muy útil en tales esfuerzos experimentales. Sincronización de las células por tratamiento con sustancias químicas que son relativamente menos tóxicos puede ser ventajoso sobre el uso de medicamentos inhibidores farmacológicos para el estudio de los eventos del ciclo celular consecuente y obtener enriquecimiento específico de las fases mitóticas. Aquí, describimos el protocolo de sincronización de las células humanas en las diferentes etapas de la célula ciclo, incluyendo ambos en fase S y fase M con un bloque doble timidina y suelte el procedimiento para el estudio de la funcionalidad de proteínas mitotic en la alineación del cromosoma y la segregación. Este protocolo ha sido muy útil para el estudio de los roles mitotic de proteínas multifuncionales que poseen funciones de interfase establecido. En nuestro caso, la función mitótica de Cdt1, una proteína crítica para replicación origen licencia en fase G1, se puede estudiar con eficacia solamente cuando Cdt1 específicas de G2/M puede ser agotado. Describimos el protocolo detallado para agotamiento de Cdt1 específicas de G2/M usando la sincronización doble de la timidina. También explicar el protocolo de la fijación de la célula y proyección de imagen de célula mediante microscopía confocal de alta resolución después del lanzamiento de timidina en vivo. El método también es útil para el análisis de la función de proteínas mitotic bajo condiciones fisiológicas y perturbadas como para Hec1, un componente del complejo Ndc80 ya que permite obtener tamaños de muestra grandes de células mitotic para fija y vivo de la célula Análisis como se muestra aquí.
Introduction
En el ciclo celular, las células se someten a una serie de eventos altamente reguladas y controladas temporal para la exacta duplicación de su genoma y su proliferación. En los mamíferos, el ciclo celular consta de interfase y fase M. En la interfase, que consta de tres etapas: G1, S, y G2, la célula duplica su genoma y experimenta un crecimiento que es necesario para el ciclo normal de la célula progresión1,2. En la fase de M, que consta de mitosis (profase, Prometafase, metafase, anafase y telofase) y citocinesis, una célula parental produce dos células hijas genéticamente idénticas. En la mitosis, la hermana chromatids del genoma duplicado son condensado (profase) y son capturadas en sus cinetocoros por microtúbulos del huso mitótico ensamblado (Prometafase), que impulsa su alineación en la placa de la metafase (metafase) seguida por su igual segregación cuando hermana cromátides se divide hacia y transportados en el eje opuesto postes (anafase). Las dos células hijas se separan físicamente por la actividad de un anillo contráctil de actina-basado (telofase y citocinesis). El cinetocoro es una estructura proteica especializada que reúne en la región centromérica de cromátides hermanas y servir como sitios de fijación para los microtúbulos del huso. Su función principal es la captura de cromosoma, alineación, y ayuda en la corrección de accesorio de microtúbulos del huso indebido, al mediar el puesto de control de ensamblaje del huso para mantener la fidelidad de cromosoma segregación3,4.
La técnica de sincronización celular sirve como una herramienta ideal para la comprensión de los eventos moleculares y estructurales implicados en la progresión del ciclo celular. Este enfoque se ha utilizado para enriquecer poblaciones de células en fases específicas de diversos tipos de análisis, incluyendo perfiles de expresión génica, análisis de los procesos bioquímicos celulares y la detección de la localización subcelular de las proteínas. Las células mamíferas sincronizadas pueden utilizarse no sólo para el estudio de productos de genes individuales, sino también de enfoques de análisis de genomas enteros, incluyendo análisis de microarray del gene expresión5, de patrones de expresión de miRNA6, regulación traduccional7y análisis proteómico de proteína modificaciones8. Sincronización puede utilizarse también para estudiar los efectos de genes o proteínas precipitación o knock-out, o de productos químicos en la progresión del ciclo celular.
Las células se pueden sincronizar en las diferentes etapas del ciclo celular. Métodos físicos y químicos son ampliamente utilizados para la sincronización celular. Los criterios más importantes para la sincronización de la célula son que la sincronización debe ser fotoefecto y reversible. Debido a las potenciales consecuencias adversas celulares de la sincronización de las células por agentes farmacológicos, métodos de química dependiente pueden ser ventajosos para el estudio de eventos del ciclo celular clave. Por ejemplo, hidroxiurea, amphidicolin, mimosina y lovastatina, pueden utilizarse para la sincronización de la célula en fase G1/S, pero, debido a su efecto sobre las vías bioquímicas que inhibir, activar mecanismos de control del ciclo celular y matar a un importante fracción de las células9,10. Por otra parte, inhibición de la regeneración de la replicación del ADN mediante la adición de timidina a los medios de crecimiento, conocidos como “bloque de timidina”, puede detener el ciclo celular en ciertos puntos11,12,13. Las células también pueden sincronizarse en fase G2/M por tratar con nocodazole y RO-33069,14. Nocodazole, que previene el montaje del microtubule, tiene una relativamente alta citotoxicidad. Por otra parte, las células nocodazole detenido puedan volver a interfase precozmente por deslizamiento mitotic. Doble timidina bloque detención en fase G1/S y después de la liberación del bloque, las células se encuentran células actuar sincrónicamente a través de G2 y mitosis. La progresión normal del ciclo celular de células de bloque de timidina puede observarse bajo microscopia confocal de alta resolución por fijación de la célula o en proyección de imagen. El efecto de la perturbación de las proteínas mitotic puede estudiarse específicamente cuando las células entraran y proceden a través de mitosis después del lanzamiento del bloque doble de timidina. Cdt1, una proteína multifuncional, está involucrado en licencias de origen de replicación de ADN en la fase G1 y se necesita para archivos adjuntos de microtúbulos cinetocoros durante mitosis15. Para estudiar la función de Cdt1 durante la mitosis, es necesario adoptar un método que evita el efecto de su agotamiento en licencias de replicación durante la fase G1, mientras que al mismo tiempo efectuar su agotamiento específicamente durante la fase G2/M solamente. Aquí, presentamos protocolos detallados basados en el bloque de timidina doble para estudiar la función mitótica de proteínas múltiples funciones durante las diferentes etapas del ciclo celular por proyección de imagen fija y células vivas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ventaja más importante de la sincronización doble de la timidina es que proporciona un tamaño de muestra mayor de células mitóticas en una ventana de tiempo corto con muchas de estas células en mitosis al unísono, así también, lo que permite el análisis de la alineación del cromosoma, bipolar eje formación y segregación cromosómica con eficiencia mucho más alta.
Muchos complejos de la proteína reguladora y vías de señalización están dedicadas a asegurar una progresión n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Kozo Tanaka de la Universidad de Tohoku, Japón para el intercambio de células HeLa expresando estable mCherry histona H2B y GFP-α-tubulina. Este trabajo fue financiado por una subvención NCI a DV (R00CA178188) y por fondos de puesta en marcha de la Universidad de Northwestern.
Materials
| DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 degree C |
| DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 degree C |
| Leibovitz’s (1X) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 degree C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 degree C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 degree C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35MM Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
References
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