Combinazione di sincronizzazione cellulare mitotica e microscopia confocale ad alta risoluzione per studiare il ruolo delle proteine del ciclo cellulare multifunzione durante la mitosi
Summary
Vi presentiamo un protocollo per la sincronizzazione della timidina doppia delle cellule HeLa seguita da analisi mediante microscopia confocale ad alta risoluzione. Questo metodo è la chiave per ottenere il numero elevato di celle che procedono in modo sincrono dalla fase S alla mitosi, permettendo studi sui ruoli mitotici delle proteine multifunzionali che possiedono anche funzioni di interfase.
Abstract
Studio dei vari eventi regolatori del ciclo cellulare in un modo dipendente dalla fase fornisce una chiara comprensione sulla crescita delle cellule e la divisione. La sincronizzazione delle popolazioni delle cellule in specifiche fasi del ciclo cellulare è stata trovata per essere molto utile in tali sforzi sperimentali. Sincronizzazione delle cellule dal trattamento con sostanze chimiche che sono relativamente meno tossico può essere vantaggioso rispetto all’uso di farmaci inibitori farmacologici per lo studio del ciclo cellulare conseguente eventi e ottenere arricchimento specifico delle fasi mitotiche selezionati. Qui, descriviamo il protocollo che sincronizzazione cellule umane nelle diverse fasi della cella ciclo, compresi sia in fase S e M con un blocco di doppia timidina e rilasciare procedura per studiare la funzionalità delle proteine mitotic in allineamento del cromosoma e la segregazione. Questo protocollo è stato estremamente utile per studiare i ruoli mitotici delle proteine multifunzionali che possiedono funzioni di interfase stabilito. Nel nostro caso, il ruolo mitotic di Cdt1, una proteina fondamentale per la replica di origine licenza nella fase G1, possa essere studiato in modo efficace solo quando Cdt1 G2/M-specifici possono essere esaurite. Descriviamo il protocollo dettagliato per lo svuotamento di G2/M specifiche Cdt1 utilizza la sincronizzazione della timidina doppia. Abbiamo anche spiegare il protocollo di fissazione delle cellule e live imaging cellulare mediante microscopia confocale ad alta risoluzione dopo il rilascio della timidina. Il metodo è anche utile per analizzare la funzione delle proteine mitotic in condizioni sia fisiologiche che sconcerta come per Hec1, un componente della Ndc80 complesso, poiché consente di ottenere campioni di grandi dimensioni di cellule mitotiche per cella fissa e dal vivo analisi come indichiamo qui.
Introduction
Nel ciclo cellulare, le cellule subiscono una serie di eventi altamente regolamentati e controllati temporaneamente per la duplicazione esatta del loro genoma e la proliferazione. Nei mammiferi, il ciclo cellulare è costituito da interfase e fase M. In interfase, che consiste di tre fasi – G1, S, e G2, la cellula Duplica il suo genoma e subisce una crescita che è necessaria per ciclo cellulare normale progressione1,2. Nella fase M, che consiste di mitosi (profase, prometafase, metafase, anafase e telofase) e citochinesi, un cellulare parentale produce due cellule figlie geneticamente identiche. Nella mitosi, sorella cromatidi del genoma duplicato sono condensati (Profase) e vengono catturati a loro cinetocori dai microtubuli del fuso mitotico assemblato (prometafase), che spinge il loro allineamento alla piastra di metafase (metafase) seguita da loro uguale segregazione quando sorella cromatidi sono diviso verso e trasportati al mandrino opposto poli (anafase). Le due cellule della figlia sono fisicamente separate dall’attività di un anello contrattile di actina-basato (telofase e citochinesi). Il cinetocore è una struttura specializzata proteinaceo che assembla alla regione centromerica di cromatidi e fungono da siti di attacco per i microtubuli dell’alberino. La sua funzione principale è di guidare la cattura del cromosoma, allineamento e aiuto nella correzione allegato microtubule mandrino improprio, mentre mediando il checkpoint di montaggio del mandrino per mantenere la fedeltà del cromosoma segregazione3,4.
La tecnica di sincronizzazione del cellulare serve come uno strumento ideale per comprendere gli eventi molecolari e strutturali coinvolti nella progressione del ciclo cellulare. Questo approccio è stato utilizzato per arricchire le popolazioni delle cellule alle fasi specifiche di vari tipi di analisi, tra cui analisi di espressione genica, analisi di processi biochimici cellulari e la rilevazione della localizzazione subcellulare delle proteine. Cellule di mammifero sincronizzate possono essere utilizzate non solo per lo studio dei prodotti genici individuali, ma anche per gli approcci di analisi di genomi interi tra cui analisi di microarray di gene espressione5, miRNA espressione modelli6, regolazione traduzionale7e l’analisi proteomica di proteina modifiche8. Sincronizzazione può anche essere utilizzato per studiare gli effetti di espressione genica o proteina knock-down o knock-out, o di sostanze chimiche sulla progressione del ciclo cellulare.
Le cellule possono essere sincronizzate nelle diverse fasi del ciclo cellulare. Metodi fisici e chimici sono ampiamente utilizzati per la sincronizzazione delle cellule. I criteri più importanti per la sincronizzazione delle cellule sono che la sincronizzazione dovrebbe essere noncytotoxic e reversibile. A causa delle potenziali conseguenze negative cellulare di sincronizzazione di cellule da agenti farmacologici, metodi chimico-dipendente possono essere vantaggiosi per studiare gli eventi chiave del ciclo cellulare. Ad esempio, hydroxyurea, amphidicolin, mimosina e lovastatina, può essere utilizzati per la sincronizzazione delle cellule in fase G1/S ma, a causa del loro effetto sulle vie biochimiche che inibiscono, attivare meccanismi di checkpoint del ciclo cellulare e uccidere un importante frazione delle cellule9,10. D’altra parte, feedback inibizione della replicazione del DNA con l’aggiunta di timidina ai media crescita, noti come “blocco” di timidina, può arrestare il ciclo cellulare a determinati punti11,12,13. È inoltre possibile sincronizzare le cellule in fase G2/M trattando con nocodazole e RO-33069,14. Nocodazole, che impedisce di microtubuli, ha una relativamente alta citotossicità. Inoltre, le cellule nocodazole-arrestato possono tornare in interfase precocemente di slittamento mitotico. Doppia timidina blocco arresto cellule alla fase G1/S e dopo il rilascio dal blocco, le cellule si trovano a procedere in modo sincrono attraverso G2 e nella mitosi. La normale progressione del ciclo cellulare per cellule rilasciato dal blocco di timidina può essere osservata in microscopia confocale ad alta risoluzione da fissazione delle cellule o formazione immagine dal vivo. L’effetto di perturbazione delle proteine mitotic possa essere studiato specificamente quando le cellule entrare e procedere attraverso mitosi dopo il rilascio dal blocco doppio della timidina. Cdt1, una proteina multifunzionale, è coinvolto nel DNA replica origine licensing in fase G1 e inoltre è richiesto per gli allegati cinetocore dei microtubuli durante la mitosi15. Per studiare la funzione di Cdt1 durante la mitosi, uno ha bisogno di adottare un metodo che evita l’effetto del suo svuotamento su replica delle licenze durante la fase G1, mentre allo stesso tempo effettuando il suo svuotamento in particolare durante la fase G2/M solo. Qui, presentiamo dettagliati protocolli basati sul blocco di timidina doppia per studiare il ruolo mitotico delle proteine eseguire diverse funzioni nelle varie fasi del ciclo cellulare da formazione immagine fissa e cellule vive.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il vantaggio più critico di sincronizzazione della timidina doppia è che fornisce una dimensione di campione maggiore di cellule mitotiche in una finestra di tempo breve con molte di queste cellule in mitosi sta entrando all’unisono, permettendo così anche analisi di allineamento del cromosoma, bipolare formazione e segregazione del cromosoma del mandrino con efficienza molto più alta.
Molti complessi proteina regolatrice e vie di segnalazione sono dedicate a garantire la normale progressi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati alla dottoressa Kozo Tanaka dell’Università di Tohoku, Giappone per la condivisione di cellule HeLa che esprimono stabilmente mCherry-istone H2B e GFP-α-tubulina. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione NCI in DV (R00CA178188) e dai fondi di Start-up presso la Northwestern University.
Materials
| DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 degree C |
| DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 degree C |
| Leibovitz’s (1X) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 degree C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 degree C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 degree C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35MM Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
References
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