Karakterisering af cellemembranen udvidelser og studere deres roller i kræft celle vedhæftning Dynamics
Summary
Denne undersøgelse viser den nytte og brugervenlighed kvantitative cellemembranen udvidelse måling og dens sammenhæng med selvklæbende kapacitet af celler. Som et repræsentativt eksempel viser vi her at Dickkopf-relaterede proteiner 3 (DKK3) fremmer øget lobopodia dannelse og celle klæbeevne i binyrebarkhormon karcinom celler i vitro.
Abstract
Cellens membran udvidelse repertoire modulerer forskellige maligne opførsel af kræftceller, herunder deres klæbende og vandrende potentialer. Evne til præcist klassificere og kvantificere celle udvidelser og måle effekten på en celle klæbende kapacitet er afgørende for at bestemme hvordan celle signalering begivenheder indvirkning kræft celle adfærd og aggressivitet. Vi beskriver her, in vitro- design og brug af en celle udvidelse kvantificering metode sammen med en vedhæftning kapacitet analyse i en etableret i vitro model for binyrebarkhormon karcinom (ACC). Specifikt, tester vi virkningerne af DKK3, en formodede tumor suppressor og en Pro differentiering faktor, på membran udvidelse Fænotypen af ACC cellelinie, SW-13. Vi foreslår disse assays til giver relativt enkel, pålidelig og let fortolkelige målinger til måler disse egenskaber under forskellige forsøgsbetingelser.
Introduction
Dysregulated WNT signalering spiller en afgørende rolle i binyrebarkhormon maligniteter1. De metoder, der anvendes i denne undersøgelse undersøge, om hæmning af DKK3, en negativ regulator af WNT signalering, repræsenterer et dedifferentiation arrangement i binyrebarken og fremmer tumordannelse inden for rammerne af celle-udvidelse repertoire ændringer. DKK3 er en 38 kDa udskilles glycoprotein med en N-terminale signal peptid og tidligere undersøgelser har vist at dens tvungen udtryk resulterede i celle cyklus anholdelse, hæmmede aggressiv ondartet adfærd, og vendt epitel-mesenkymale overgangen2.
Den maligne opførsel af binyrebarkhormon karcinom (ACC) og andre kræftformer er del, påvirket af evne til tumorceller at interface med de omkringliggende overflader, herunder den ekstracellulære matrix, som til gengæld letter tumor celle invasion og migration3. Rollen specifikke cellemembranen udvidelser i kræft progression er demonstreres i stigende grad i forskellige sammenhænge, primært via dannelsen af filopodia. For eksempel har overekspression af L-type calcium kanaler vist sig at fremkalde filopodia dannelse og fremme tumor celle invasion4. Fascin, en actin bindende protein minimalt udtrykt i normalt væv, er ligeledes også overexpressed i kræftceller i forening med filopodia dannelse5. Lobopodia dannelse muliggør ikke-maligne fibroblaster overflytte effektivt gennem det ekstra-cellulære matrix, men det har vist sig at fibrosarcoma celler er afhængige af metalloproteinase aktivitet i stedet for lobopodia til at lette celle migration og invasion6. Vi har vist, at tumor undertrykkerne, herunder Ras association domæne familie 1 isoform en (RASSF1A) og DKK3, kan funktionen til at ændre cytoskeletal elementer og fremme lamellipodia dannelse og styne invasive egenskaber7,8.
Som sådan, er det kritisk at karakterisere effekten af gener involveret i carcinogenese og deres forhold til cellemembranen udvidelse ændringer, specielt vurdering af filopodia, lobopodia og lamellipodia dannelse under prøvningsbetingelser. Nuværende state-of-the-art teknikker omfatter brug af stadig mere avancerede mikroskopi metoder, fluorescerende mærkning, og/eller komplekse edb-algoritmer til dataopsamling og fortolkning. Mens disse metoder til at give nye og stærke analytiske værktøjer, begrænser deres kompleksitet deres udbredte anvendelse og tilpasningsevne i celle biologi eksperimenter. Desuden er præcis kvantificering og observation af ændringer i celle udvidelse morfologi ikke typisk målte9,10. Derimod introducerer vi en teknik, som nøjagtigt kvantificerer celle udvidelse ændringer ved hjælp af standard mikroskopiske teknikker og let fleksibel in vitro- metoder. Disse metoder også kvantificere hver celle forlængelse skrive samtidig for hver celle, analyseres og afgøre overordnede ændringer i cellens membran udvidelse repertoire. Vi viser også, hvordan disse ændringer kan relateres til celle vedhæftning egenskaber.
Som en eksperimenterende eksempel, vil vi bruge en tidligere oprettet cellelinie af SW-13, udpeget SW-DDK3, der har været stabilt transfekteret med pCMV6-post/DKK3 plasmid vektorer og constitutively overexpresses DKK3, en differentiering faktor i binyrerne. Non-transfekteret SW-13 celler og SW-13 celler stabilt transfekteret med tomme vektor (pCMV6-post), udpeget SW-Neo, vil tjene som eksperimentelle kontrolelementer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en in vitro- kvantitativ metode for at karakterisere celle extensions med lethed, par pit-falls og pålidelige reproducerbarhed, der kan anvendes til forskellige prøvningsbetingelser. Derudover kan simple, kvantificerbare vedhæftning og/eller motilitet assays udføres samtidigt for at korrelere potentielle funktionel betydning af observerede ændringer i cellens membran udvidelser.
Disse metoder kan fremsætte nogle potentielle begrænsninger. Først, de kriterier, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ohse Grant Foundation finansieret dette arbejde.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
- Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
- Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297 (2016).
- Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
- Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
- Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87 (2013).
- Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905 (2017).
