Karakterisering van de celmembraan extensies en het bestuderen van hun rollen in kanker cel adhesie Dynamics
Summary
Deze studie toont het nut en het gemak van kwantitatieve celmembraan extensie meting en de correlatie met zelfklevende capaciteit van cellen. Als een representatief voorbeeld, laten we zien hier dat Dickkopf-gerelateerde eiwitten 3 (DKK3) bevordert de vorming van de verhoogde lobopodia en cel hechting in adrenocortical carcinoom cellen in vitro.
Abstract
De celmembraan extensie repertoire moduleert verschillende kwaadaardige gedrag van kankercellen, met inbegrip van hun potentieel zelfklevende en trekvogels. De mogelijkheid om nauwkeurig te classificeren en te kwantificeren cel extensies en te meten van het effect op van een cel zelfklevende capaciteit is van cruciaal belang om te bepalen hoe cel-signalering gebeurtenissen effect kanker cel gedrag en agressie. Hier beschrijven we de in vitro ontwerp en het gebruik van een cel kwantificering uitbreidingsmethode in combinatie met een hechting capaciteit test in een vastgestelde in vitro model voor adrenocortical carcinoom (ACC). Specifiek, testen we de effecten van DKK3, een vermeende tumor suppressor en een Pro-differentiatie factor, op het membraan extensie fenotype van de ACC cellijn, SW-13. Stellen wij voor deze tests om relatief eenvoudige, betrouwbare en makkelijk interpreteerbaar maatstelsel meet deze kenmerken onder verschillende experimentele omstandigheden.
Introduction
Dysregulated WNT signalering speelt een cruciale rol in adrenocortical maligniteiten1. De methoden die worden gebruikt in deze studie onderzoeken of zwijgen van DKK3, een negatieve regulator van de WNT signalering, vertegenwoordigt een dedifferentiation gebeurtenis in de bijnierschors en bevordert de vorming van de tumor in het kader van cel-extensie repertoire wijzigingen. DKK3 is een 38 kDa glycoproteïne met een N-terminal signaal peptide afgescheiden en vorige studies hebben aangetoond dat haar gedwongen meningsuiting in de arrestatie van de celcyclus resulteerde, geremd agressief gedrag van de kwaadaardige en omgekeerd epitheliale-mesenchymale overgang2.
Het maligne gedrag van adrenocortical carcinoom (ACC) en andere vormen van kanker is, gedeeltelijk beïnvloed door het vermogen van tumorcellen met de omringende oppervlakken, met inbegrip van de extracellulaire matrix, wat op zijn beurt tumor cel invasie vergemakkelijkt en migratie3. De rol van specifieke celmembraan extensies in de progressie van kanker wordt steeds worden aangetoond in verschillende contexten, vooral via de vorming van filopodia. Bijvoorbeeld, is overexpressie van L-type calcium kanalen gebleken dat induceren filopodia vorming te bevorderen van tumor cel invasie4. Ook Fascin, een bindende eiwit minimaal actine uitgedrukt in normale weefsel, is ook overexpressie in kankercellen i.s.m. filopodia formatie5. Lobopodia formatie laat niet-maligne fibroblasten effectief migreren door middel van de extra-cellulaire matrix, echter het heeft aangetoond dat fibrosarcoma cellen vertrouwen op metalloproteinase activiteit in plaats van lobopodia te vergemakkelijken van cel migratie en invasie6. We hebben aangetoond dat tumor suppressors, met inbegrip van de Ras vereniging domein familie 1 isovorm een (RASSF1A) en DKK3, kan functioneren te veranderen cytoskeletal elementen en bevordering van de vorming van de lamellipodia en invasieve eigenschappen7,8te belemmeren.
Als zodanig, is het cruciaal voor het karakteriseren van de effecten van genen betrokken bij carcinogenese en hun relatie tot de celmembraan extensie, wijzigingen specifiek beoordeling van filopodia, lobopodia en lamellipodia vorming onder testomstandigheden. Huidige state-of-the art technieken omvatten het gebruik van steeds geavanceerdere Microscopie methodes, fluorescerende labelen en/of complexe algoritmes voor data-acquisitie en interpretatie. Hoewel deze methoden nieuwe en krachtige analytische instrumenten bieden, beperkt hun complexiteit hun wijdverbreid gebruik en aanpassingsvermogen in cel biologie-experimenten. Bovendien, de precieze kwantificering en de observatie van veranderingen in cel extensie morfologie is niet typisch gemeten9,10. In tegenstelling, introduceren we een techniek hier die nauwkeurig kwantificeert cel extensie wijzigingen met behulp van standaard microscopische technieken en gemakkelijk aanpasbaar in vitro methoden. Deze methoden ook kwantificeren van elk celtype uitbreiding gelijktijdig voor elke cel geanalyseerd en algemene wijzigingen in het celmembraan extensie repertoire vaststellen. Ook laten we zien hoe deze veranderingen kunnen betrekking hebben op de eigenschappen van de hechting van de cel.
Als een experimentele voorbeeld gebruiken we een eerder gemaakte cellijn van SW-13, aangewezen SW-DDK3, die heeft zijn stabiel transfected met pCMV6-post/DKK3 plasmide vectoren en constitutively overexpresses DKK3, een onderscheidende factor in de bijnier. Non-transfected cellen van het SW-13 en SW-13 cellen stabiel transfected met lege vector (pCMV6-Entry), aangewezen SW-Neo, zal dienen als experimentele besturingselementen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een in vitro kwantitatieve methode karakteriseren cel extensies met gemak, paar pit-watervallen en betrouwbare reproduceerbaarheid die kan worden toegepast voor de verschillende testomstandigheden. Eenvoudige, kwantificeerbare hechting en/of beweeglijkheid testen kunnen bovendien gelijktijdig worden uitgevoerd om te correleren potentiële functionele betekenis van waargenomen veranderingen in celmembraan extensies.
Deze methoden kunnen echter enkele mogelijke beper…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De Stichting Arbo subsidie gefinancierd dit werk.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
- Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
- Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297 (2016).
- Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
- Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
- Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87 (2013).
- Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905 (2017).
