Caratterizzazione delle estensioni della membrana cellulare e studiando i loro ruoli nella dinamica di adesione delle cellule cancro
Summary
Questo studio dimostra l’utilità e la facilità di misurazione estensione quantitativa della membrana cellulare e la sua correlazione alla capacità adesiva delle cellule. Come un esempio rappresentativo, indichiamo qui quella proteina correlata Dickkopf 3 (DKK3) promuove la formazione aumentata lobopodia e adesività delle cellule nel carcinoma corticosurrenale cellule in vitro.
Abstract
Repertorio di estensione della membrana cellulare modula vari comportamenti maligni delle cellule tumorali, comprese le potenzialità adesive e migratori. La capacità di classificare e quantificare le estensioni delle cellule con precisione che misura l’effetto sulla capacità adesiva di una cella è fondamentale per determinare come cellula-segnalazione eventi impatto cancro cella comportamento e aggressività. Qui, descriviamo in vitro progettazione e l’uso di un cella quantificazione metodo di estensione in combinazione con un’analisi di capacità di adesione a un modello stabilito in vitro per carcinoma corticosurrenale (ACC). In particolare, ci prova gli effetti di DKK3, un oncosoppressore putativo e un fattore di pro-differenziazione, il fenotipo di membrana estensione della linea cellulare ACC, SW-13. Vi proponiamo queste analisi per fornire relativamente semplice, affidabile e facilmente interpretabili metriche di misura queste caratteristiche nelle varie circostanze sperimentali.
Introduction
Dysregulated WNT segnalazione svolge un ruolo critico nella malignità corticosurrenale1. I metodi utilizzati in questo studio studiare se il silenziamento di DKK3, un regolatore negativo di segnalazione WNT, rappresenta un evento di dedifferenziazione nella corteccia surrenale e promuove la formazione del tumore nel contesto dei cambiamenti del repertorio di cella-estensione. DKK3 è un 38 kDa secreto glicoproteina con un peptide segnale N-terminale e gli studi precedenti hanno dimostrato che la sua espressione forzata provocato l’arresto del ciclo cellulare, ha inibito il comportamento maligno aggressivo e invertito epiteliale-mesenchimale passaggio2.
Il comportamento maligno di carcinoma corticosurrenale (ACC) e di altri cancri è, in parte, influenzato dalla capacità delle cellule del tumore per interfacciarsi con le superfici circostanti, tra cui la matrice extracellulare, che a sua volta facilita l’invasione delle cellule del tumore e migrazione3. Il ruolo delle estensioni specifiche della membrana cellulare nella progressione del cancro è essere sempre più dimostrato in vari contesti, soprattutto attraverso la formazione di filopodi. Ad esempio, sovraespressione dei canali del calcio tipo L è stata trovata per indurre la formazione di filopodi e promuovere di invasione delle cellule del tumore4. Allo stesso modo, fascina, un’actina proteina legante minimamente espresso nel tessuto normale, è anche overexpressed in cellule di cancro in associazione con filopodi formazione5. Lobopodia formazione permette di fibroblasti non-maligne a migrare in modo efficace attraverso la matrice extra-cellulare, tuttavia, è stato dimostrato che cellule di fibrosarcoma si basano su attività della proteinasi metallica al posto di lobopodia per facilitare la migrazione delle cellule e invasione di6. Abbiamo dimostrato che il tumore soppressori, tra cui Ras associazione dominio famiglia 1 isoforma un (RASSF1A) e DKK3, può funzionare per modificare elementi del citoscheletro e promuovere la formazione di lamellipodi e stymie proprietà dilaganti7,8.
Come tale, è fondamentale per caratterizzare gli effetti di geni coinvolti nella carcinogenesi e loro relazione con le alterazioni di estensione della membrana cellulare, in particolare valutare filopodi, lobopodia e lamellipodi formazione in condizioni di prova. Attuale stato-of-the-art tecniche includono l’uso di metodi sempre più sofisticati di microscopia, Contrassegno fluorescente e/o algoritmi informatici complessi per acquisizione dati e di interpretazione. Mentre questi metodi forniscono nuovi e potenti strumenti analitici, la loro complessità limita l’uso molto diffuso e l’adattabilità in esperimenti di biologia cellulare. Inoltre, la quantificazione precisa e l’osservazione dei cambiamenti nella morfologia delle cellule estensione non è in genere misurata9,10. Al contrario, vi presentiamo qui una tecnica che quantifica con precisione le alterazioni di estensione di cella utilizzando tecniche microscopiche standard e metodi facilmente adattabile in vitro . Questi metodi inoltre quantificare ogni tipo di estensione delle cellule contemporaneamente per ogni cella analizzato e determinano cambiamenti complessivi del repertorio di estensione della membrana cellulare. Mostriamo anche come questi cambiamenti possono riguardare proprietà di adesione delle cellule.
Ad esempio sperimentale, utilizzeremo una linea cellulare creato in precedenza di SW-13, designato SW-DDK3, che ha stato transfected stabile con vettori del plasmide pCMV6-voce/DKK3 e costitutivamente overexpresses DKK3, un fattore di differenziazione nella ghiandola adrenale. SW-13 non-transfettati e SW-13 celle transfettate stabile con il vettore vuoto (pCMV6-voce), designato SW-Neo, servirà come controlli sperimentali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo un metodo quantitativo in vitro per caratterizzare le estensioni delle cellule con facilità, pochi pit-cade e riproducibilità affidabile che può essere applicato per diverse condizioni di test. Inoltre, semplice, quantificabili saggi di adesione e/o motilità possono essere eseguite simultaneamente per correlare il potenziale significato funzionale delle alterazioni osservate nelle estensioni della membrana cellulare.
Tuttavia, questi metodi possono presentare alcun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ohse Grant della Fondazione finanziato quest’opera.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
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