Caracterização de extensões da membrana celular e estudando seus papéis na dinâmica de adesão celular câncer
Summary
Este estudo demonstra a utilidade e a facilidade de medição de extensão quantitativa da membrana celular e sua correlação com capacidade adesiva de células. Como um exemplo representativo, mostramos aqui essa proteína relacionada ao Dickkopf 3 (DKK3) promove aumento lobopodia formação e aderência de célula em carcinoma adrenocortical em vitrode células.
Abstract
Repertório de extensão da membrana celular modula vários comportamentos malignos das células cancerosas, incluindo seus potenciais de adesivo e migratórias. A capacidade de precisão de classificar e quantificar as extensões de célula e medir o efeito sobre a capacidade adesiva da célula é fundamental para determinar como célula-sinalização de eventos impacto câncer célula comportamento e agressividade. Aqui, descrevemos em vitro concepção e utilização de um celular extensão quantificação método em conjunto com um ensaio de capacidade de aderência em um modelo estabelecido em vitro para carcinoma adrenocortical (ACC). Especificamente, nós testamos os efeitos da DKK3, um supressor de tumor putativo e um fator de pró-diferenciação, sobre o fenótipo de extensão de membrana da linha celular ACC, SW-13. Propomos estes ensaios para fornecer relativamente simples, confiável e facilmente interpretável métricas para as medidas estas características sob diferentes condições experimentais.
Introduction
Dysregulated WNT sinalização desempenha um papel crítico na malignidades adrenocortical1. Os métodos utilizados neste estudo investigam se silenciar de DKK3, um regulador negativo de sinalização WNT, representa um evento de quê no córtex adrenal e promove a formação de tumor no contexto de alterações de repertório de célula-extensão. DKK3 é um 38 kDa secretado glicoproteína com um peptídeo sinal do N-terminal e estudos anteriores demonstraram que sua expressão forçada resultou na detenção do ciclo celular, inibiu o comportamento agressivo do maligno e invertida epitelial-mesenquimal transição2.
O comportamento maligno do carcinoma adrenocortical (ACC) e outros tipos de câncer é, em parte, influenciada pela capacidade de células tumorais para fazer a interface com as superfícies circundantes, incluindo a matriz extracelular, que por sua vez facilita a invasão de células do tumor e migração de3. O papel das extensões específicas de membrana celular na progressão do câncer é cada vez mais sendo demonstrado em diversos contextos, principalmente através da formação de filopodia. Por exemplo, foi encontrado para induzir a formação de filopodia e promover de invasão de células de tumor4superexpressão dos canais de cálcio tipo L. Da mesma forma, Fascin, um ligação proteína minimamente o actínio expressa em tecido normal, é também Blumental em células cancerosas em associação com filopodia formação5. Lobopodia formação permite que não-malignas fibroblastos efetivamente migrar através da matriz extra-celular, no entanto, tem sido demonstrado que células de Fibrossarcoma dependem de metaloproteinase atividade substituem lobopodia para facilitar a migração celular e invasão de6. Mostramos esse tumor supressores, incluindo Ras Associação domínio família 1 isoform um (RASSF1A) e DKK3, pode funcionar para alterar elementos do citoesqueleto e promover a formação de lamellipodia e obste Propriedades invasivas7,8.
Como tal, é fundamental para caracterizar os efeitos de genes envolvidos na carcinogênese e sua relação com alterações de extensão da membrana celular, avaliando especificamente a formação filopodia, lobopodia e lamellipodia sob condições de teste. Atual estado da arte técnicas incluem o uso de métodos cada vez mais sofisticados de microscopia, etiquetando fluorescente e/ou algoritmos de computador complexo para aquisição de dados e interpretação. Enquanto esses métodos fornecem novas e poderosas ferramentas analíticas, sua complexidade limita sua utilização generalizada e adaptabilidade em experimentos de biologia celular. Além disso, a quantificação precisa e observação de alterações na morfologia de extensão de célula não é normalmente medido9,10. Em contrapartida, apresentamos aqui uma técnica que quantifica com precisão alterações de extensão de célula usando técnicas padrão microscópicas e facilmente adaptável em vitro métodos. Esses métodos também quantificar cada tipo de extensão de células simultaneamente para cada célula analisado e determinar mudanças gerais no repertório de extensão da membrana celular. Também mostramos como essas alterações podem se relacionar Propriedades de adesão celular.
Como um exemplo experimental, vamos usar uma linha de celular criado anteriormente de SW-13, designado SW-DDK3, que tem sido estàvel transfected com vetores de plasmídeo pCMV6-entrada/DKK3 e constitutivamente overexpresses DKK3, um factor diferenciador na glândula adrenal. Non-transfectadas SW-13 células e células SW-13 estàvel transfectadas com vetor vazio (pCMV6-entrada), designado SW-Neo, servirá como controles experimentais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós descrevemos um em vitro método quantitativo para caracterizar as extensões de células com facilidade, algumas armadilhas e reprodutibilidade confiável que pode ser aplicada para as várias condições de teste. Além disso, ensaios de aderência e/ou motilidade simples e quantificáveis podem ser executados simultaneamente para correlacionar o potencial significado funcional das alterações observadas nas extensões da membrana celular.
No entanto, estes métodos podem …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A Fundação de Grant Sesma financiado este trabalho.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
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