Karakterisering av cellmembranet tillägg och studera deras roller i Cancer Cell Adhesion Dynamics
Summary
Denna studie visar nytta och användarvänlighet kvantitativa cellmembranet förlängning mätning och dess korrelation till självhäftande kapacitet av celler. Som ett typexempel visar vi här det Dickkopf-relaterade proteinet 3 (DKK3) främjar ökad lobopodia bildning och cell vidhäftning i adrenokortikal cancer celler in vitro.
Abstract
Cellmembranets förlängning repertoar modulerar olika maligna beteenden av cancerceller, inklusive deras självhäftande och flyttfåglar potential. Förmågan att noggrant klassificera och kvantifiera cell tillägg och mäta effekten på cellens självhäftande kapacitet är avgörande för att fastställa hur cell-signalering händelser inverkan cancercellers beteende och aggressivitet. Vi beskriver här, in vitro- design och en cell filändelsen kvantifiering metod i samband med en vidhäftning kapacitet analys i en etablerad in vitro- modell för adrenokortikal carcinom (ACC). Specifikt, testar vi effekterna av DKK3, en förmodad tumörsuppressor och en Pro differentiering faktor, på membran förlängning fenotypen av raden cell ACC, SW-13. Vi föreslår dessa analyser att ge relativt enkel, tillförlitlig och lätt tolkningsbara mätvärden till åtgärder dessa egenskaper under olika experimentella förhållanden.
Introduction
Dysregulated WNT signalering spelar en avgörande roll i adrenokortikal maligniteter1. De metoder som används i denna studie undersöka om ljuddämpning av DKK3, en negativ regulator av WNT signalering, representerar en Dedifferentiering händelse i binjurebarken och främjar tumörbildning i samband av cell-extension repertoar förändringar. DKK3 är en 38 kDa utsöndras glykoprotein med en N-terminal signal peptid och tidigare studier har visat att dess påtvingade uttryck resulterade i cellcykelarrest, inhiberad aggressiva elakartade beteende och omvänd epitelial-mesenkymala övergången2.
Malignt beteende adrenokortikal carcinom (ACC) och andra cancerformer är, i del, influerad av tumörceller förmåga att samverka med de omgivande ytorna, inklusive den extracellular matrisen, vilket i sin tur underlättar tumör cell invasion och migration3. Rollen för specifika cellmembranet extensions i cancer progression demonstreras alltmer i olika sammanhang, främst via bildandet av filopodia. Överuttryck av L-typ kalciumkanaler har exempelvis visat att framkalla filopodia bildas och främja tumör cell invasion4. Likaså staden, en aktin bindande protein minimalt uttryckt i normal vävnad, är också överuttryckt i cancerceller i samband med filopodia bildning5. Lobopodia bildande möjliggör icke-maligna fibroblaster att migrera effektivt genom extra-cellulära matrisen, det har dock visat att fibrosarkom celler åberopa metalloproteinas aktivitet i stället för lobopodia att underlätta cellmigration och invasion6. Vi har visat att tumören dämpning, inklusive Ras association domän familj 1 isoform en (RASSF1A) och DKK3, kan funktionen för att ändra cytoskeletal element och främja lamellipodia bildning och hämmas invasiva egenskaper7,8.
Som sådan, är det viktigt att karakterisera effekterna av gener involverade i carcinogenes och deras relation till cellmembranet förlängning förändringar, särskilt bedöma filopodia, lobopodia och lamellipodia bildning under provningsförhållanden. Aktuella staten-of-the-art tekniker inkluderar användning av alltmer sofistikerade mikroskopi metoder, fluorescerande märkning eller komplexa datoralgoritmer för datainsamling och tolkning. Medan dessa metoder ger nya och kraftfulla analytiska verktyg, begränsar deras komplexitet deras utbredd användning och anpassningsförmåga i cellbiologi experiment. Dessutom är den exakt kvantifiering och observation av förändringar i cellmorfologi förlängning inte vanligtvis uppmätta9,10. Däremot införa vi en teknik här som exakt kvantifierar cell filändelsen förändringar med standard mikroskopiska tekniker och lätt anpassningsbar in vitro- metoder. Dessa metoder även kvantifiera varje celltyp förlängning samtidigt för varje cell som analyseras och fastställa övergripande förändringar i cellmembranet förlängning repertoar. Vi visar också hur dessa förändringar kan relatera till cell vidhäftningsegenskaper.
Som en experimentell exempel, kommer att vi använda en tidigare skapad cell fodrar SW-13, designerat SW-DDK3, som har transfekterats stabilt med pCMV6-posten/DKK3 plasmid vektorer och konstitutivt overexpresses DKK3, en särskiljande faktorn i binjuren. Icke-transfekterade SW-13 och SW-13 celler stabilt transfekterade med tom vektor (pCMV6-post), designerat SW-Neo, kommer att tjäna som experimentella kontroller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en in vitro- kvantitativ metod för att karakterisera cell tillägg med lätthet, några pit-faller och tillförlitlig reproducerbarhet som kan tillämpas för olika förhållanden. Dessutom kan enkel, kvantifierbara vidhäftning eller motilitet analyser utföras samtidigt för att korrelera potentiella funktionell betydelse av observerade förändringar i cellmembranet filändelser.
Dessa metoder kan dock medföra vissa potentiella begränsningar. Först, de kriteri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ohse Grant stiftelsen finansierat detta arbete.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
- Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
- Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297 (2016).
- Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
- Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
- Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87 (2013).
- Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905 (2017).
