وتعرض هذه الورقة طريقة تنطوي على التوليف وتوصيف لاستهداف الوحيدات المذيلات أمفيفيلي الببتيد والمقابلة لها فحوصات لاختبار توافق مع الحياة وقدرة مذيل لربط وحيدات.
تصلب الشرايين هو مساهم رئيسي في أمراض القلب والشرايين، السبب الرئيسي للوفاة في العالم، الذي يدعى حياة 17.3 مليون سنوياً. تصلب الشرايين هو أيضا السبب الرئيسي للموت المفاجئ واحتشاء عضلة القلب، بتحريض من لويحات غير المستقرة التي تمزق وأوككلودي الأوعية الدموية دون سابق إنذار. التصوير الطرائق الحالية لا يمكن التفريق بين لويحات المستقرة وغير المستقرة التي تمزق. الببتيد أمفيفيليس المذيلات (PAMs) يمكن التغلب على هذا العيب كما أنها يمكن تعديلها مع مجموعة متنوعة من استهداف مويتيس التي تربط على وجه التحديد للأنسجة المريضة. أظهرت وحيدات لتكون علامات مبكرة لتصلّب الشرايين، بينما يرتبط تراكم كبير من وحيدات مع لويحات المعرضة للتمزق. ومن ثم، يمكن استخدام الجسيمات النانوية التي يمكن أن تستهدف وحيدات لتميز مراحل مختلفة من تصلب الشرايين. تحقيقا لهذه الغاية، هنا، يمكننا وصف بروتوكول لإعداد الوحيدات-استهداف PAMs (الوحيدات chemoattractant البروتين-1 (العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1) PAMs). PAMs العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 يتم تجميعها ذاتيا من خلال التوليف تحت ظروف معتدلة بشكل جسيمات نانوية من 15 نانومتر في قطر بالقرب من تهمة السطحية محايدة. في المختبر، PAMs تم العثور على أن يكون متوافق حيويا وكان تقارب ملزم عالية وحيدات. إظهار الأساليب الموصوفة هنا وعد لمجموعة واسعة من التطبيقات في تصلب الشرايين، فضلا عن الأمراض الالتهابية الأخرى.
أمراض القلب والأوعية الدموية تبقى إلى أن الأسباب الرئيسية للوفاة على الصعيد العالمي مع حوالي1من 17.3 مليون حالة وفاة في جميع أنحاء العالم. أمراض القلب والأوعية الدموية هي أسهم بتصلب الشرايين، شرط فيها لويحات تتراكم في الشرايين، مما يمنع الدم وتدفق الأكسجين إلى خلايا الجسم2،3. ويشمل تطور تصلب الشرايين تصلب الشرايين وسماكة الاستجابة الالتهابية، والايض الدهني غير النظامية، وتراكم البلاك، مما يؤدي إلى اللوحة تمزق واحتشاء عضلة القلب4،5. خلايا بطانية التعبير عن جزيئات السيتوكينات والالتصاق، التي تشمل العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 التي تربط لمستقبلات تشيموكيني ج-C (CCR2) الموجودة على سطح وحيدات6،،من78. تحويل الكولسترول المؤكسد وحيدات إلى الضامة خلال المرحلة المبكرة من تشكيل اللوحة، مما يضاعف الاستجابة الالتهابية في المنطقة ويؤدي إلى إصابة الأنسجة وتشكيل لويحات غير مستقرة أو الضعيفة9، 10.
عادة، يتم تقييم تصلب الشرايين بتقييم لومينال تضيق التشريحية التصوير باستخدام الموجات فوق الصوتية أو تصوير الأوعية11،12. ومع ذلك، هذه الأساليب يمكن فقط تحديد تضييق شديد للجدار الشرياني وليس في مرحلة مبكرة من تصلب الشرايين، كما يؤدي النمو اللوحة الأولى يعيد البناء الشرياني الحفاظ على حجم الشريان والدم تدفق معدل12،13، 14. ولذلك، أونديريبريسينت أنجيوجرامس انتشار تصلب الشرايين. بالإضافة إلى ذلك، حسبت موسع تقنيات التصوير مثل انبعاث فوتون واحد التصوير المقطعي والتصوير المقطعي بالبوزيترون، والتصوير بالرنين المغناطيسي مؤخرا قد استخدمت لتوصيف مورفولوجيا اللوحة كما أنها يمكن أن توفر التفاصيل الأولية و توصيف لويحات. ومع ذلك، هذه الطرائق غالباً محدودة بسبب الافتقار إلى الحساسية، القرار المكانية، أو تتطلب استخدام الإشعاع المؤين، مما يجعل التصوير البلاك التقدم في مختلف مراحل أكثر تحديا1615،، 17. ويظل نظام تصوير للتسليم أن تحدد على وجه التحديد لويحات في مراحل مختلفة من تصلب الشرايين توضع.
جسيمات نانوية أظهرت أن تكون منصة ناشئة في فيفو البلاك الاستهداف والتشخيص18،19،،من2021. على وجه الخصوص، PAMs مفيدة نظراً لتنوع المواد الكيميائية والقدرة على استيعاب مجموعة متنوعة من مويتيس والتراكيب، والأحجام، والأشكال والسطحية الروغان22. أمفيفيليس الببتيد (PAs) تتكون من ماء، الببتيد “هيدجروب” يعلق على ذيل مسعور، التي عادة ما تكون الدهون؛ هذا الهيكل amphiphilic يضفي قدرات ذاتية التركيب ويسمح لعرض متعددي الببتيدات على سطح الجسيمات22،،من2324. هيادجروبس الببتيد يمكن أن تؤثر على شكل الجسيمات عن طريق الطي والربط بين الببتيدات25الهيدروجين. أظهرت الببتيدات أمثال من خلال التفاعل β-ورقة لتشكيل المذيلات ممدود، بينما يمكن أن تشكل تأكيد α-حلزونية كلا المذيلات كروية وطوله22،،من2324، 25،،من2627. يمكن وضع linkers البولي إثيلين غليكول (شماعة) أن الدرع بتهمة الببتيد السطحية بين الببتيد ماء وذيل مسعور PAMs، تعزيز توافر نانوحبيبات في الدوران الجهازي28، 29 , 30 , 31-PAMs أيضا مفيدة لأنها متوافق حيويا وقد ثبت أن لديها مجموعة واسعة من التطبيقات32،33. قابلية الذوبان في الماء من المذيلات يوفر ميزة على سائر الأنظمة المستندة إلى نانوحبيبات مثل بعض الجسيمات النانوية البوليمرية التي هي غير قابلة للذوبان في الماء، ويجب أن تكون قد علقت في سولوبيليزيرس لحقن34. بالإضافة إلى ذلك، يجعل القدرة على خلق PAMs أن تفكيك في الاستجابة لمحفزات محددة PAMs مرشح جذابة ل توصيل العقاقير الخاضعة للمراقبة داخل الخلايا35.
ملزمة لمستقبلات CCR2 وتتراكم في قوس الاورطي، وضعت PAMs سابقا الوحيدات تستهدف رصد المراحل المختلفة للآفات تصلب الشرايين في الشريان الاورطي9. في الفئران-/- الذين يزيد تراكم الوحيدات تناسبياً إلى اللوحة تقدم36. وعلاوة على ذلك، وجد أن المرضى الذين يعانون من لويحات المعرضة لتمزق، والمرحلة المتأخرة تحتوي على كميات أعلى من وحيدات37. ولذلك، بتعديل PAMs لإدماج العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 مفيد لأنه يسمح لقدر أكبر من الدقة الاستهداف والتفريق بين الآفات المبكرة والمتأخرة من مرحلة تصلب الشرايين. كما أن هذه الدراسات دليلاً على مفهوم التحقق من أن PAMs أمنا بما يكفي لاستخدامها بريكلينيكالي ويتم مسح رينالى38. وحيدات والتهاب مميزة للأمراض الأخرى، PAMs العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 يكون يمكن أن تستخدم للتطبيقات التشخيصية والعلاجية في أمراض أخرى وراء تصلب الشرايين8،،من3940 , 41.
هنا، نحن تقرير تلفيق PAMs العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 قابلة الغاية وتجميعها ذاتيا التي أظهرت الحجم الأمثل للجسيمات وتهمة السطحية، والاستهداف الانتقائي وحيدات لتطبيقات الصور المحسنة في تصلب الشرايين.
PAMs العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 هي منصة تصوير جزيئي واعدة، تتألف من الببتيد استهداف ماء وذيل مسعور الذي يدفع بطبيعة نانوحبيبات تجميعها ذاتيا. يمكن إعداد هذا مذيل استهداف الوحيدات بتوليف بسيطة وخطوات تنقية العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 الببتيد ودسب-شماعة (2000)-العملية التشا?…
The authors have nothing to disclose.
الكتاب يود أن ينوه دعم مالي من جامعة كاليفورنيا الجنوبية وقلب الوطنية والرئة، والدم معهد (NHLBI)، R00HL124279، وايلي واديت جائزة الابتكار واسعة ومؤسسة ويتير عدم-السرطان جائزة البحوث متعدية الجنسيات الممنوحة للمجموعة. يشكر المؤلفون المركز الميكروسكوب الإلكتروني وسليكيه، ومركز التميز في نانوبيوفيسيكس، ومركز التميز “التوصيف الجزيئي” ويشغل مركز تصوير في جامعة كاليفورنيا الجنوبية للمساعدة في الأجهزة مفيدة.
1,2-ethanedithiol | VWR | E0032 | for peptide synthesis |
10 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-898 | for cell culture |
15 mL centrifuge tubes, polypropylene | VWR | 89401-566 | for various applications |
2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | for MALDI |
25 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | for cell culture |
2-Mercaptoethanol, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | for cell culture |
5 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-896 | for cell culture |
50 mL centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | for various applications |
75 cm2 culture flask | Fisher Scientific | 13-680-65 | for cell culture |
75 mL reaction vessel | Protein Technologies | 3000005 | for peptide synthesis |
96-wells cell culture plate | VWR | 40101-346 | for MTS assay |
Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A998SK-4 | for HPLC purification |
Borosilicate glass, 1 dram | VWR | 66011-041 | for PAM synthesis |
Borosillicate glass pipet, Long tips | VWR | 14673-043 | for various applications |
Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | for confocal microscopy |
Cy5 amine | Abcam | ab146463 | for peptide conjugation |
Diethyl ether, ACS grade | Fisher Scientific | E138-1 | for peptide precipitation |
Disposable syringes, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | for HPLC purification |
Double neubauer ruled hemocytometer | VWR | 63510-13 | for cell counting |
DSPE-PEG(2000) amine | Avanti | 880128P | for peptide conjugation |
DSPE-PEG(2000) maleimide | Avanti | 880126P | for peptide conjugation |
DSPE-PEG(2000)-NHS ester | Nanocs | PG2-DSNS-10K | for conjugation to Cy5 |
Dulbecco's modified eagle medium-high glucose | Sigma Aldrich | D5796-500ML | for cell culture |
Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 10438026 | for cell culture |
Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | for peptide synthesis |
Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh | Novabiochem | 856013 | for peptide synthesis |
Formic acid, optima LC/MS grade | Fisher Scientific | A117-50 | for HPLC purification |
Glycerol | VWR | M152-1L | for confocal microscopy |
Hand tally counter | Fisher Scientific | S90189 | for cell counting |
Magnetic stir bars, egg-shaped | VWR | 58949-006 | for peptide conjugation |
Methanol, ACS certified | Fisher Scientific | A412-4 | for PAM synthesis |
MTS cell proliferation colorimetric assay kit | VWR | 10191-104 | for MTS assay |
N,N-Dimethylformamide, sequencing grade | Fisher Scientific | BP1160-4 | for peptide synthesis |
N-Methylmorpholine | Protein Technologies | S-1L-NMM | for peptide synthesis |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416780250 | for fixing cells |
PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for various applications |
Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | for cell culture |
Peptide synthesis vessel, 25 mL | Fisher Scientific | CG186011 | for peptide synthesis |
Phosphotungstic acid | Fisher Scientific | A248-25 | for TEM |
Piperidine | Spectrum | P1146-2.5LTGL | for peptide synthesis |
Plain glass microscope slide 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for confocal microscopy |
Reagent reservoirs, sterile | VWR | 95128093 | for cell culture |
Self-closing tweezer | TedPella | 515 | for TEM |
TEM support film | TedPella | 01814F | for TEM |
Trifluoroacetic acid | Fisher Scientific | BP618-500 | for peptide cleavage and HPLC purification |
Triisopropylsilane | VWR | TCT1533-5ml | for peptide cleavage |
Trypan blue solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
Tweezer, general purpose-serrated | VWR | 231-SA-SE | for confocal microscopy |
WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | murine monocyte |
automated benchtop peptide synthesizer | Protein Technologies | PS3 Benchtop Peptide Synthesizer | |
α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | for MALDI |