Síntesis de monocito-targeting Peptide Amphiphile micelas para la proyección de imagen de la aterosclerosis
Summary
Este documento presenta un método que implica la síntesis y caracterización de micelas de amphiphile péptido monocito-targeting y los correspondientes ensayos para prueba de biocompatibilidad y capacidad de la micela a monocitos.
Abstract
La ateroesclerosis es una importante contribución a las enfermedades cardiovasculares, la principal causa de muerte en todo el mundo, que afirma 17,3 millones de vidas anualmente. La aterosclerosis es también la principal causa de muerte súbita e infarto de miocardio, instigado por las placas inestables que se rompen y ocluyan los vasos sanguíneos sin previo aviso. Corriente de las modalidades de la proyección de imagen no puede diferenciar entre placas estables e inestables que la ruptura. Micelas de Anfífilos péptido (PAMs) pueden superar esta desventaja puede ser modificado con una variedad de dirigidos a grupos que se unen específicamente al tejido enfermo. Monocitos han demostrado ser marcadores tempranos de la aterosclerosis, mientras que la gran acumulación de monocitos se asocia con placas propensas a la ruptura. Por lo tanto, nanopartículas que pueden dirigirse a monocitos pueden utilizarse para discriminar diferentes etapas de la aterosclerosis. Para ello, aquí, se describe un protocolo para la preparación de monocito-PAMs (monocito chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). PAMs de MCP-1 uno mismo-se ensamblan a través de síntesis condiciones suaves en forma de nanopartículas de 15 nm de diámetro con cerca de carga superficie neutra. In vitro, PAM fueron encontrada para ser biocompatible y tenían una alta afinidad para monocitos. Los métodos descritos en este documento muestran promesa para una amplia gama de aplicaciones en la aterosclerosis, así como otras enfermedades inflamatorias.
Introduction
Las enfermedades cardiovasculares están pendientes de las principales causas de muerte a nivel mundial con aproximadamente 17,3 millones de muertes en todo el mundo1. Las enfermedades cardiovasculares son aportadas por la ateroesclerosis, una condición en la que las placas se acumulan en las arterias, la sangre de tal modo inhibiendo y el flujo de oxígeno a las células del cuerpo2,3. La progresión de la ateroesclerosis consiste en el engrosamiento y endurecimiento de las arterias por una acumulación de placa, lleva a placa4,de ruptura e infarto de miocardio5, respuesta inflamatoria y metabolismo lipídico irregular. Las células endoteliales expresan moléculas de citocinas y de la adherencia, como MCP-1 que enlaza con el C-C chemokine receptor (CCR2) encuentran en la superficie de monocitos6,7,8. Colesterol oxidado convierte monocitos en macrófagos durante la etapa temprana de formación de la placa, que amplifica la respuesta inflamatoria en la región y lleva a la lesión tisular y la formación de placas inestables o vulnerables9, 10.
Tradicionalmente, la ateroesclerosis se evalúa mediante la evaluación de estenosis luminal por la proyección de imagen anatómica con ecografía o angiografía11,12. Sin embargo, estos métodos pueden determinar sólo estrechamiento severo de la pared arterial y no la etapa temprana de la aterosclerosis, como causas de crecimiento de la placa inicial remodelado arterial mantener el tamaño de la arteria y de la sangre flujo tasa12,13, 14. Por lo tanto, los angiogramas ricas prevalencia de ateroesclerosis. Además, técnicas de imagen no invasivas como la sola emisión del fotón computan la tomografía, tomografía por emisión de positrones y la resonancia magnética se han utilizado recientemente para caracterizar la morfología de la placa como pueden proporcionar información inicial y caracterización de las placas. Sin embargo, estas modalidades son limitadas a menudo por la falta de sensibilidad, resolución espacial, o requieren el uso de radiaciones ionizantes, que imagen progresión de placa en diferentes etapas mucho más desafiante15,16, 17. Un sistema de entrega imagen que identificara concretamente las placas en diferentes etapas de la aterosclerosis es a desarrollar.
Las nanopartículas han demostrado ser una plataforma emergente para en vivo placa orientación y diagnóstico18,19,20,21. En particular, PAMs son ventajosas debido a su diversidad química y capacidad para acomodar una variedad de grupos, composiciones, tamaños, formas y funcionalización de superficies22. Péptido Anfífilos (PAs) consiste en un péptido “headgroup hidrofílico,” unido a una cola hidrofóbica, que suelen ser lípidos; Esta estructura anfifílicas confiere capacidades de uno mismo-montaje y permite una visualización multivalente de péptidos en la superficie de la partícula22,23,24. El péptido contiene puede afectar la forma de la partícula a través de plegables y el hidrógeno de la vinculación entre péptidos25. Péptidos que se dobla a través de la interacción β-hoja han demostrado formar micelas alargadas, mientras que α-helicoidal confirmación puede formar dos micelas esféricas y alargada22,23,24, 2526,de,27. Enlazadores de polietilenglicol (PEG) que proteja la carga superficial del péptido pueden colocarse entre el péptido hidrofílico y cola hidrofóbica de PAMs, mejorar la disponibilidad de la nanopartícula en circulación sistémica28, 29 , 30 , 31. PAM también es ventajosa porque son biocompatibles y se ha demostrado que tienen una amplia gama de aplicaciones32,33. La solubilidad en agua de micelas ofrece una ventaja sobre otros sistemas basados en nanopartículas como ciertas nanopartículas poliméricas que no son solubles en agua y tienen que ser suspendido en solubilizantes para inyecciones34. Además, la habilidad de crear PAMs que desmontarán en respuesta a un estímulo específico hace PAM un candidato atractivo para la entrega controlada de drogas intracelular35.
Por Unión al receptor CCR2 y acumulando en el arco aórtico, PAMs fueron desarrolladas previamente para monocitos targeting para monitorear las diferentes etapas de las lesiones ateroscleróticas en la aorta9. En ratones ApoE– / – acumulación de monocitos aumenta proporcionalmente a la progresión de placa36. Además, se encontró que los pacientes con placas propensas a la ruptura, última etapa contienen altas cantidades de monocitos37. Por lo tanto, la modificación de los PAMs para incorporar MCP-1 es útil porque permite mayor especificidad segmentación y diferenciación entre las lesiones ateroscleróticas de etapa temprana y tardía. Estos estudios de prueba de concepto también verificaron que la PAMs son lo suficientemente seguras como ser utilizado pre-clinically y se borran renally38. Puesto que los monocitos y la inflamación son característicos de otras enfermedades, PAMs de MCP-1 tienen el potencial de ser utilizado para los usos terapéuticos y de diagnósticos en otras enfermedades más allá de ateroesclerosis8,39,40 , 41.
Adjunto, divulgamos la fabricación altamente escalable y uno mismo-montado PAMs de MCP-1 que demostró tamaño óptimo de partícula, carga superficial y focalización selectiva a monocitos para aplicaciones de imágenes mejoradas en la aterosclerosis.
Protocol
Representative Results
Discussion
PAMs de MCP-1 es una plataforma de proyección de imagen molecular prometedora, que consiste en un péptido targeting hidrofílica y cola hidrofóbica que impulsa la naturaleza uno mismo-montada de la nanopartícula. Esta micela metas de monocitos puede prepararse por síntesis simple y pasos de la purificación de la MCP-1 péptido DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs tienen muchas características beneficiosas para en vivo imagen molecular como su autoensamblaje bajo condiciones suaves, Biodegradabilidad intrínseca y …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer el apoyo financiero de la Universidad de California del sur, el corazón nacional, pulmón y sangre Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli y Edythe amplio Premio a la innovación y el L.K. Whittier Fundación no-cáncer Premio investigación traslacional al EJC. Los autores agradecen el centro de microscopía electrónica y microanálisis, centro de excelencia en NanoBiophysics, centro de excelencia para la caracterización Molecular y traslacional Imaging Center en la Universidad de California meridional para asistencia en configuraciones instrumentales.
Materials
| 1,2-ethanedithiol | VWR | E0032 | for peptide synthesis |
| 10 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-898 | for cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | VWR | 89401-566 | for various applications |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | for MALDI |
| 25 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | for cell culture |
| 2-Mercaptoethanol, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | for cell culture |
| 5 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-896 | for cell culture |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | for various applications |
| 75 cm2 culture flask | Fisher Scientific | 13-680-65 | for cell culture |
| 75 mL reaction vessel | Protein Technologies | 3000005 | for peptide synthesis |
| 96-wells cell culture plate | VWR | 40101-346 | for MTS assay |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A998SK-4 | for HPLC purification |
| Borosilicate glass, 1 dram | VWR | 66011-041 | for PAM synthesis |
| Borosillicate glass pipet, Long tips | VWR | 14673-043 | for various applications |
| Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | for confocal microscopy |
| Cy5 amine | Abcam | ab146463 | for peptide conjugation |
| Diethyl ether, ACS grade | Fisher Scientific | E138-1 | for peptide precipitation |
| Disposable syringes, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | for HPLC purification |
| Double neubauer ruled hemocytometer | VWR | 63510-13 | for cell counting |
| DSPE-PEG(2000) amine | Avanti | 880128P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000) maleimide | Avanti | 880126P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000)-NHS ester | Nanocs | PG2-DSNS-10K | for conjugation to Cy5 |
| Dulbecco's modified eagle medium-high glucose | Sigma Aldrich | D5796-500ML | for cell culture |
| Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 10438026 | for cell culture |
| Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | for peptide synthesis |
| Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh | Novabiochem | 856013 | for peptide synthesis |
| Formic acid, optima LC/MS grade | Fisher Scientific | A117-50 | for HPLC purification |
| Glycerol | VWR | M152-1L | for confocal microscopy |
| Hand tally counter | Fisher Scientific | S90189 | for cell counting |
| Magnetic stir bars, egg-shaped | VWR | 58949-006 | for peptide conjugation |
| Methanol, ACS certified | Fisher Scientific | A412-4 | for PAM synthesis |
| MTS cell proliferation colorimetric assay kit | VWR | 10191-104 | for MTS assay |
| N,N-Dimethylformamide, sequencing grade | Fisher Scientific | BP1160-4 | for peptide synthesis |
| N-Methylmorpholine | Protein Technologies | S-1L-NMM | for peptide synthesis |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416780250 | for fixing cells |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for various applications |
| Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | for cell culture |
| Peptide synthesis vessel, 25 mL | Fisher Scientific | CG186011 | for peptide synthesis |
| Phosphotungstic acid | Fisher Scientific | A248-25 | for TEM |
| Piperidine | Spectrum | P1146-2.5LTGL | for peptide synthesis |
| Plain glass microscope slide 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for confocal microscopy |
| Reagent reservoirs, sterile | VWR | 95128093 | for cell culture |
| Self-closing tweezer | TedPella | 515 | for TEM |
| TEM support film | TedPella | 01814F | for TEM |
| Trifluoroacetic acid | Fisher Scientific | BP618-500 | for peptide cleavage and HPLC purification |
| Triisopropylsilane | VWR | TCT1533-5ml | for peptide cleavage |
| Trypan blue solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| Tweezer, general purpose-serrated | VWR | 231-SA-SE | for confocal microscopy |
| WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | murine monocyte |
| automated benchtop peptide synthesizer | Protein Technologies | PS3 Benchtop Peptide Synthesizer | |
| α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | for MALDI |
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