Syntese af monocyt-targeting peptid Amphiphile Micelles til billeddannelse af åreforkalkning
Summary
Dette paper præsenterer en metode, der involverer syntese og karakterisering af monocyt-targeting peptid amphiphile micelles og de tilsvarende undersøgelser for at teste for biokompatibilitet og micelle evne til at binde til monocytter.
Abstract
Åreforkalkning er en stor bidragyder til hjerte-kar-sygdom, den hyppigste årsag til dødsfald på verdensplan, som hævder 17,3 millioner liv hvert år. Åreforkalkning er også den hyppigste årsag til pludselig død og myokardieinfarkt, iværksat af ustabile plaques, som brud og occlude blodkar uden advarsel. Aktuelle imaging modaliteter kan ikke skelne mellem stabil og ustabil plaques, at briste. Peptid amphiphiles micelles (PAMs) kan overvinde denne ulempe, da de kan ændres med en bred vifte af målretning fraspaltning, der bindes specifikt til sygt væv. Monocytter har vist sig at være tidlige markører for åreforkalkning, mens store ophobning af monocytter er forbundet med plaques tilbøjelige til at briste. Derfor, nanopartikler, der kan målrette monocytter kan anvendes til at skelne forskellige stadier af åreforkalkning. Med henblik herpå, her, vi beskriver en protokol for forberedelse af monocyt-targeting PAMs (monocyt chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs samles selv gennem syntese under milde forhold til form nanopartikler af 15 nm i diameter med nær neutral overflade afgift. In vitro, PAMs fandtes for at være biokompatible og havde en høj bindende affinitet for monocytter. De metoder, der beskrives heri viser lovende for en bred vifte af applikationer i åreforkalkning samt andre inflammatoriske sygdomme.
Introduction
Hjerte-kar-sygdomme er fortsat for at være de førende dødsårsager globalt med ca 17,3 millioner dødsfald på verdensplan1. Hjerte-kar-sygdomme er bidraget af åreforkalkning, en tilstand, hvor plaques ophobes i arterier, derved hæmmende blod og ilt flow til cellerne i kroppen2,3. Progression af aterosklerose indebærer fortykkelse og hærdning af arterierne ved en inflammatorisk respons, uregelmæssige lipid metabolisme og plaque oprustning, fører til plaque brud og myokardieinfarkt4,5. Endotelceller express cytokiner og vedhæftning molekyler, som omfatter MCP-1, der binder sig til C-C chemokine receptor (CCR2) fundet på overfladen af monocytter6,7,8. Oxideret kolesterol konverterer monocytter til makrofager i den tidlige fase af plaque dannelse, som forstærker den inflammatoriske reaktion i regionen og fører til vævsskade og dannelse af ustabile eller sårbare plaques9, 10.
Traditionelt, er åreforkalkning evalueret ved at vurdere luminale stenose af anatomiske imaging bruge angiografi eller ultralyd11,12. Men disse metoder kan kun bestemme svær forsnævring af arterievæggen og ikke den tidlige fase af åreforkalkning, som indledende plaque vækst forårsager arteriel remodeling at opretholde arterie størrelse og blood flow hastighed12,13, 14. Derfor underrepresent angiograms åreforkalkning prævalens. Derudover noninvasive billedbehandling teknikker som single photon emission beregnet tomografi, positron emissions tomografi og magnetisk resonans imaging har for nylig blevet brugt til at karakterisere plaque morfologi, som de kan give oprindelige detaljer og karakterisering af plaques. Men disse metoder er ofte begrænset af manglen følsomhed, rumlige opløsning, eller kræver brug af ioniserende stråling, gør imaging plaque progression på forskellige stadier langt mere udfordrende15,16, 17. En billeddannelse levering system, der ville specifikt at identificere plaques på forskellige stadier af åreforkalkning er stadig skal udvikles.
Nanopartikler har vist sig for at være en spirende platform for i vivo plaque målretning og diagnostik18,19,20,21. Især er PAMs fordelagtig på grund af deres kemiske diversitet og evnen til at rumme en række fraspaltning, kompositioner, størrelser, figurer og overflade functionalization22. Peptid amphiphiles (PAs) består af en hydrofil, peptid “headgroup” knyttet til en hydrofobe hale, som er typisk lipider; denne amphiphilic struktur giver selvsamlende kapaciteter og giver mulighed for en multivalent visning af peptider på overfladen af partikel22,23,24. Peptid headgroups kan påvirke partikel form gennem foldning og brint limning mellem peptider25. Peptider, fold gennem β-plade interaktion har vist sig at danne aflange micelles, mens α-spiralformet bekræftelse kan danne både sfærisk og aflange micelles22,23,24, 25,26,27. Polyethylenglycol (PEG) linkers, som skjold overflade afgiften af peptid kan placeres mellem den hydrofile peptid og den hydrofobe hale af PAMs, forbedre tilgængeligheden af nanopartikler i systemisk cirkulation28, 29 , 30 , 31. PAMs er ligeledes fordelagtig, fordi de er biokompatible og har vist sig at have en bred vifte af applikationer32,33. Micelles vandopløselighed tilbyder en fordel over andre nanopartikel-baseret systemer såsom visse polymere nanopartikler, der ikke er opløseligt i vand og suspenderes i solubilizers for injektioner34. Derudover gør mulighed for at oprette PAMs at demontere som svar på en specifik stimuli PAMs en attraktiv kandidat til kontrolleret intracellulære drug delivery35.
Ved at binde til CCR2 receptoren og akkumulere i aortabuen, var PAMs tidligere udviklet til monocyt målretning til at overvåge forskellige stadier af aterosklerotiske læsioner i aorta9. I ApoE– / – mus, monocyt akkumulering øges proportionalt til plaque progression36. Det konstateredes desuden, at patienter med brud-tilbøjelige, sene plaques indeholder større mængder af monocytter37. Ændring af PAMs at indarbejde MCP-1 er derfor nyttigt, fordi det giver mulighed for større målretning specificitet og differentiering mellem tidlige – og sene aterosklerotiske læsioner. Disse proof-of-concept undersøgelser også bekræftet at PAMs er sikker nok til at blive brugt pre-clinically og er ryddet renally38. Da monocytter og inflammation er karakteristiske for andre sygdomme, har MCP-1 PAMs potentiale til at blive anvendt til terapeutiske og diagnostiske programmer i andre sygdomme ud over åreforkalkning8,39,40 , 41.
Heri, rapporterer vi fabrikation af yderst skalerbar og selvsamlede MCP-1 PAMs, som viste partiklen optimal størrelse, overflade afgift og selektiv målretning til monocytter for forøget tænkelig andragender i åreforkalkning.
Protocol
Representative Results
Discussion
MCP-1 PAMs er en lovende molekylær billeddannelse platform, bestående af en hydrofil målretning peptid og hydrofobe hale, der driver nanopartikel selvsamlede karakter. Denne monocyt-targeting micelle kan fremstilles ved simpel syntese og rensning trin af MCP-1 peptid og DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs har mange gavnlige egenskaber for i vivo molecular imaging som deres samlesæt under milde betingelser, iboende bionedbrydelighed og strukturelle og kemiske mangfoldighed giver mulighed for indarbejdning af andre bi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende den finansielle støtte fra University of Southern California, National Heart, Lung, og Blood Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli og Edythe bred Innovation Award og Larsen Whittier Foundation Non-kræft Translationel forskning Award givet til Quraishy. Forfatterne takke centrum for Elektron Mikroskopi og mikroanalyser, Center of Excellence i NanoBiophysics, Center of Excellence for Molekylær karakterisering og Translational Imaging Center ved University of Southern California for bistand i instrumental opsætninger.
Materials
| 1,2-ethanedithiol | VWR | E0032 | for peptide synthesis |
| 10 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-898 | for cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | VWR | 89401-566 | for various applications |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | for MALDI |
| 25 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | for cell culture |
| 2-Mercaptoethanol, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | for cell culture |
| 5 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-896 | for cell culture |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | for various applications |
| 75 cm2 culture flask | Fisher Scientific | 13-680-65 | for cell culture |
| 75 mL reaction vessel | Protein Technologies | 3000005 | for peptide synthesis |
| 96-wells cell culture plate | VWR | 40101-346 | for MTS assay |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A998SK-4 | for HPLC purification |
| Borosilicate glass, 1 dram | VWR | 66011-041 | for PAM synthesis |
| Borosillicate glass pipet, Long tips | VWR | 14673-043 | for various applications |
| Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | for confocal microscopy |
| Cy5 amine | Abcam | ab146463 | for peptide conjugation |
| Diethyl ether, ACS grade | Fisher Scientific | E138-1 | for peptide precipitation |
| Disposable syringes, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | for HPLC purification |
| Double neubauer ruled hemocytometer | VWR | 63510-13 | for cell counting |
| DSPE-PEG(2000) amine | Avanti | 880128P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000) maleimide | Avanti | 880126P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000)-NHS ester | Nanocs | PG2-DSNS-10K | for conjugation to Cy5 |
| Dulbecco's modified eagle medium-high glucose | Sigma Aldrich | D5796-500ML | for cell culture |
| Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 10438026 | for cell culture |
| Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | for peptide synthesis |
| Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh | Novabiochem | 856013 | for peptide synthesis |
| Formic acid, optima LC/MS grade | Fisher Scientific | A117-50 | for HPLC purification |
| Glycerol | VWR | M152-1L | for confocal microscopy |
| Hand tally counter | Fisher Scientific | S90189 | for cell counting |
| Magnetic stir bars, egg-shaped | VWR | 58949-006 | for peptide conjugation |
| Methanol, ACS certified | Fisher Scientific | A412-4 | for PAM synthesis |
| MTS cell proliferation colorimetric assay kit | VWR | 10191-104 | for MTS assay |
| N,N-Dimethylformamide, sequencing grade | Fisher Scientific | BP1160-4 | for peptide synthesis |
| N-Methylmorpholine | Protein Technologies | S-1L-NMM | for peptide synthesis |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416780250 | for fixing cells |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for various applications |
| Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | for cell culture |
| Peptide synthesis vessel, 25 mL | Fisher Scientific | CG186011 | for peptide synthesis |
| Phosphotungstic acid | Fisher Scientific | A248-25 | for TEM |
| Piperidine | Spectrum | P1146-2.5LTGL | for peptide synthesis |
| Plain glass microscope slide 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for confocal microscopy |
| Reagent reservoirs, sterile | VWR | 95128093 | for cell culture |
| Self-closing tweezer | TedPella | 515 | for TEM |
| TEM support film | TedPella | 01814F | for TEM |
| Trifluoroacetic acid | Fisher Scientific | BP618-500 | for peptide cleavage and HPLC purification |
| Triisopropylsilane | VWR | TCT1533-5ml | for peptide cleavage |
| Trypan blue solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| Tweezer, general purpose-serrated | VWR | 231-SA-SE | for confocal microscopy |
| WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | murine monocyte |
| automated benchtop peptide synthesizer | Protein Technologies | PS3 Benchtop Peptide Synthesizer | |
| α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | for MALDI |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
- Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12 (2006).
- Rahmani, M., Cruz, R. P., Granville, D. J., McManus, B. M. Allograft Vasculopathy Versus Atherosclerosis. Circ. Res. 99 (8), 801-815 (2006).
- Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature (London, U. K). 473 (7347), 317-325 (2011).
- Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature (London). 394 (6696), 894-897 (1998).
- Szmitko, P. E., et al. New Markers of Inflammation and Endothelial Cell Activation. Circulation. 108 (16), 1917-1923 (2003).
- Deshmane, S. L., Kremlev, S., Amini, S., Sawaya, B. E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. Interferon Cytokine Res. 29 (6), 313-326 (2009).
- Chung, E. J., et al. Monocyte-Targeting Supramolecular Micellar Assemblies: A Molecular Diagnostic Tool for Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (3), 367-376 (2015).
- Chung, E. J. Targeting and therapeutic peptides in nanomedicine for atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 891-898 (2016).
- Sanz, J., Fayad, Z. A. Imaging of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature (London, U. K.). 451 (7181), 953-957 (2008).
- Tarkin, J. M., et al. Imaging Atherosclerosis. Circ. Res. 118 (4), 750-769 (2016).
- Hennerici, M., Baezner, H., Daffertshofer, M. Ultrasound and arterial wall disease. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 19-33 (2004).
- Nissen, S. E. Application of intravascular ultrasound to characterize coronary artery disease and assess the progression or regression of atherosclerosis. Am J Cardiol. 89 (4A), 24B-31B (2002).
- Khalil, M. M., Tremoleda, J. L., Bayomy, T. B., Gsell, W. Molecular SPECT Imaging: An Overview. Int J Mol Imaging. 2011, 796025 (2011).
- Lerakis, S., et al. Imaging of the vulnerable plaque: noninvasive and invasive techniques. Am J Med Sci. 336 (4), 342-348 (2008).
- Sun, Z. H., Rashmizal, H., Xu, L. Molecular imaging of plaques in coronary arteries with PET and SPECT. J Geriatr Cardiol. 11 (3), 259-273 (2014).
- Godin, B., et al. Emerging applications of nanomedicine for the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases. Trends Pharmacol. Sci. 31 (5), 199-205 (2010).
- Branco de Barros, A. L., Tsourkas, A., Saboury, B., Cardoso, V. N., Alavi, A. Emerging role of radiolabeled nanoparticles as an effective diagnostic technique. EJNMMI Res. 2 (1), 31-39 (2012).
- Jayagopal, A., Linton, M. F., Fazio, S., Haselton, F. R. Insights into atherosclerosis using nanotechnology. Curr. Atheroscler. Rep. 12 (3), 209-215 (2010).
- Khodabandehlou, K., Masehi-Lano, J. J., Poon, C., Wang, J., Chung, E. J. Targeting cell adhesion molecules with nanoparticles using in vivo and flow-based in vitro models of atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 242 (8), 799-812 (2017).
- Trent, A., Marullo, R., Lin, B., Black, M., Tirrell, M. Structural properties of soluble peptide amphiphile micelles. Soft Matter. 7 (20), 9572-9582 (2011).
- Hartgerink, J. D., Beniash, E., Stupp, S. I. Peptide-amphiphile nanofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (8), 5133-5138 (2002).
- Missirlis, D., et al. Effect of the Peptide Secondary Structure on the Peptide Amphiphile Supramolecular Structure and Interactions. Langmuir. 27 (10), 6163-6170 (2011).
- Zhong, L., Johnson, W. C. Environment affects amino acid preference for secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (10), 4462-4465 (1992).
- Shimada, T., Lee, S., Bates, F. S., Hotta, A., Tirrell, M. Wormlike Micelle Formation in Peptide-Lipid Conjugates Driven by Secondary Structure Transformation of the Headgroups. J. Phys. Chem. B. 113 (42), 13711-13714 (2009).
- Missirlis, D., et al. Linker Chemistry Determines Secondary Structure of p5314-29 in Peptide Amphiphile Micelles. Bioconjugate Chem. 21 (3), 465-475 (2010).
- Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu. Rev. Mater. Sci. 26, 365-394 (1996).
- Xue, Y., O’Mara, M. L., Surawski, P. P. T., Trau, M., Mark, A. E. Effect of Poly(ethylene glycol) (PEG) Spacers on the Conformational Properties of Small Peptides: A Molecular Dynamics Study. Langmuir. 27 (1), 296-303 (2011).
- Canalle, L. A., Loewik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Polypeptide-polymer bioconjugates. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 329-353 (2010).
- Hamley, I. W. PEG-Peptide Conjugates. Biomacromolecules. 15 (5), 1543-1559 (2014).
- Acar, H., et al. Self-assembling peptide-based building blocks in medical applications. Adv. Drug Delivery Rev. , (2016).
- Busseron, E., Ruff, Y., Moulin, E., Giuseppone, N. Supramolecular self-assemblies as functional nanomaterials. Nanoscale. 5 (16), 7098-7140 (2013).
- Barrett, J. C., et al. Modular Peptide Amphiphile Micelles Improving an Antibody-Mediated Immune Response to Group A Streptococcus. ACS Biomater. Sci. Eng. 3 (2), 144-152 (2017).
- Toughrai, S., et al. Reduction-Sensitive Amphiphilic Triblock Copolymers Self-Assemble Into Stimuli-Responsive Micelles for Drug Delivery. Macromol. Biosci. 15 (4), 481-489 (2015).
- Swirski, F. K., et al. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (27), 10340-10345 (2006).
- Kashiwagi, M., et al. Association of monocyte subsets with vulnerability characteristics of coronary plaques as assessed by 64-slice multidetector computed tomography in patients with stable angina pectoris. Atherosclerosis (Amsterdam, Neth). 212 (1), 171-176 (2010).
- Chung, E. J., Tirrell, M. Recent Advances in Targeted, Self-Assembling Nanoparticles to Address Vascular Damage Due to Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (16), 2408-2422 (2015).
- Cassetta, L., Pollard, J. W. Cancer immunosurveillance: role of patrolling monocytes. Cell Res. 26 (1), 3-4 (2016).
- Williams, C. B., Yeh, E. S., Soloff, A. C. Tumor-associated macrophages: unwitting accomplices in breast cancer malignancy. NPJ Breast Cancer. 2, (2016).
- Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and Macrophages in Cancer: Development and Functions. Cancer Microenviron. 6 (2), 179-191 (2013).
- Schick, M. J. Effect of temperature on the critical micelle concentration of nonionic detergents. Thermodynamics of micelle formation. J. Phys. Chem. 67 (9), 1796-1799 (1963).
- Marullo, R., Kastantin, M., Drews, L. B., Tirrell, M. Peptide contour length determines equilibrium secondary structure in protein-analogous micelles. Biopolymers. 99 (9), 573-581 (2013).
- Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C. L., Beyreuther, K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer’s disease βA4 peptides. J. Mol. Biol. 228 (2), 460-473 (1992).
- Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. Amino Acid Contribution to Protein Solubility: Asp, Glu, and Ser Contribute more Favorably than the other Hydrophilic Amino Acids in RNase Sa. J. Mol. Biol. 366 (2), 449-460 (2007).
- Kim, S. W., Shi, Y. Z., Kim, J. Y., Park, K. N., Cheng, J. X. Overcoming the barriers in micellar drug delivery: Loading efficiency, in vivo stability, and micelle-cell interaction. Expert Opin Drug Delivery. 7 (1), 49-62 (2010).
- Rangel-Yagui, C. O., Pessoa, A., Tavares, L. C. Micellar solubilization of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 8 (2), 147-163 (2005).
- Batrakova, E., et al. Fundamental relationships between the composition of pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. Pharm. Res. 16 (9), 1373-1379 (1999).
- Chen, L. J., Lin, S. Y., Huang, C. C. Effect of Hydrophobic Chain Length of Surfactants on Enthalpy-Entropy Compensation of Micellization. J. Phys. Chem. B. 102 (22), 4350-4356 (1998).
