Ortotópico trasplante ovárico procedimientos para investigar la influencia de la vida y salud de la senescencia ovárica en ratones hembra
Summary
Aquí descritos es orthotopic trasplante ovárico protocolos para modificar el ovario influencia sobre la fisiología del ratón receptor. Este procedimiento quirúrgico se utiliza para exponer ratones hembra a los varios tipos de influencia ovárico y puede incluir trasplantes heterocrónicas y el trasplante de ovarios que han experimentado diversos tratamientos ex vivo .
Abstract
Trasplante de ovario fue realizado primero en Utah State University en 1963. En la obra más reciente, heterocrónicas trasplante de ovarios mamíferos se utiliza para investigar los efectos protectores de la salud de jóvenes ovarios en mujeres jóvenes. Los procedimientos actuales emplean un método de trasplante orthotopic, donde se trasplantaron ovarios alógenos regresa a su posición original en la bursa ovárica. Esto está en contraste con el más comúnmente usado heterotopic trasplante de tejido ovárico/ovarios por vía subcutánea o bajo la cápsula renal. Todos los tres lugares ofrecen eficiente revascularización de los tejidos trasplantados. Sin embargo, el trasplante orthotopic del ovario proporciona el medio de señalización más natural y es el único procedimiento que ofrece la oportunidad del animal para reproducirse naturalmente postoperatoriamente. Uno debe tener cuidado para eliminar todo el tejido ovárico endógeno durante el procedimiento de la ovariectomía. Si queda cualquier tejido endógeno o si sólo se extirpa un ovario, el tejido trasplantado permanecerá inactivo hasta que el tejido existente se vuelve senescente. Mientras que la revascularización de los ovarios trasplantados se produce muy rápidamente, el receptor de trasplante puede tomar una cantidad considerable de tiempo para adaptarse a un nuevo eje de (HPG/A) hipotalámico/pituitario/gonadal/suprarrenal señalización régimen asociado con el trasplante tejido. Esto normalmente toma alrededor de 100 días en el ratón. Por lo tanto, experimentos de trasplante deben ser diseñados para acomodar este período de adaptación. Resultados típicos con el trasplante de ovario incluyen cambios en la salud de la receptora que reflejan la edad del ovario trasplantado, en lugar de la edad cronológica del destinatario.
Introduction
La influencia de la reproducción sobre la salud y la vida es a menudo erróneamente considerado como restringido sólo al período que abarca la competencia reproductiva. Mientras que el estilo de vida y fenotipos asociados a la fase reproductivamente competente de la vida se distinguen fácilmente de las fases previas y postreproductive, estado reproductivo influye en la salud en todas las fases de la vida. El período de capacidad reproductiva se refiere a menudo como la vida reproductiva, diferenciarse de la vida cronológica. Esta terminología se presta a una separación artificial de las dos designaciones de vida cuando en realidad, ambos están estrechamente ligada entre sí con los eventos que afectan a uno, más a menudo que no, que afectan a la otra así.
Evidencia en la última década indica que estado reproductivo de un individuo se asocia con un mayor riesgo de desarrollar condiciones de salud crónicas1. Un estudio documentaron una asociación entre vidas más cortas y falla reproductiva para una cohorte de hombres2. La asociación es aún más llamativo en las mujeres. La enfermedad cardiovascular es rara en las mujeres premenopáusicas3, pero fallo ovárico aumenta la enfermedad cardiovascular considerablemente en la menopausia4 y en mujeres jóvenes con falla ovárica prematura5. Pérdida de hueso y6 de resistencia de insulina aumentan en la menopausia7 y casi dos tercios de los estadounidenses con la enfermedad de Alzheimer son mujeres8. Cambios bien definidos en la señalización de ovario marcan la transición de un estado premenopáusico, resistentes a enfermedades, a un estado posmenopáusico, carga de enfermedad. Esta transición estable, presenta una oportunidad para identificar mecanismos que aceleren los riesgos de enfermedad en el envejecimiento.
Recientemente, el trasplante de tejido ovárico criopreservado se ha utilizado para restaurar la fertilidad en las mujeres que se someten a procedimientos médicos que pueden poner en peligro las células de la línea del germen, como la quimioterapia. Trasplante de tejido ovárico también puede utilizarse para producir descendencia viable en animales con infertilidad en base no ovárico, incluyendo ratones transgénicos9. Trasplante de ovario es un método eficiente para separar la influencia de la función reproductiva o envejecimiento reproductivo de envejecimiento cronológico por sí.
El papel de apoyo bien establecido para las hormonas ováricas en muchos aspectos de la salud implica la pérdida de producción de la hormona de ciclismo activamente las células germinales, como la principal causa de los riesgos de la enfermedad creciente en la menopausia. Mientras que el valor de las hormonas ováricas en la mujer salud es incuestionable, reemplazo de estas hormonas en peri y postmenopáusicas ha sido poco fiable en la restauración de los beneficios de salud de mujeres jóvenes con ovarios pequeños. Estos beneficios para la salud se restauran confiablemente por heterocrónicas trasplante de ovarios joven a ratones hembra postreproductive10,11,12,13,14.
Estado reproductivo de los ratones tanto donante como receptor debe determinarse antes y después del trasplante o procedimientos de ovariectomía. Ratones postreproductive presuntivos que muestran signos de entrada gonadal antes de la cirugía a los 12 meses de edad quedan excluidos de estos experimentos. Entrada gonadal está determinado por citología vaginal. Se recogen datos sobre citología vaginal cirugía previa por lo menos 10 días consecutivos para un estado postreproductive en ratones receptores y ciclismo activamente los ovarios de ratones donantes. Un ciclo estral se define como el período comprendido entre el día nucleated células epiteliales aparecen por primera vez (es decir, proestro) hasta el día anterior a la próxima aparición de las células epiteliales nucleadas en el frotis vaginal, siempre que exista un período de leucocitos presencia (es decir, diestro) en el medio. Estro es determinado por la presencia de células epiteliales escamosas, grandes, con o sin núcleos. Ratones no mostrar ninguna actividad cíclica para un período de 10 días antes o después de la cirugía están decididos a no tener ninguna entrada gonadal para dicho período. Ratones mostrar al menos un ciclo estral completo en un período de 10 días antes o después de la cirugía están decididos a tener entrada gonadal para dicho período. Ratones hembra deben ubicados en presencia de ratones machos o expuestos a la ropa de cama sucia de la jaula del macho para asegurar la constante exposición a los estímulos inductores de ciclo.
Estos procedimientos de trasplante se logran más eficientemente con dos cirujanos trabajando simultáneamente en donante y receptoras ratones. Sin embargo, los procedimientos se logran fácilmente por un cirujano, con los ovarios de la donante suele recuperados antes de iniciar el procedimiento de la ovariectomía sobre el ratón receptor. Este protocolo describe el procedimiento para el cirujano solo. Exposición del tracto reproductivo y el cierre del sitio normalmente se hacen sin un microscopio, mientras que la remoción y reemplazo de los ovarios se hace bajo un microscopio. Como con cualquier procedimiento quirúrgico de aprendizaje, sitios de la incisión pueden ser más grandes y cirugías pueden durar mientras el procedimiento de aprendizaje primera y generalmente disminuyen con la experiencia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ovariectomía y a trasplante de ovarios intactos y agotamiento de la célula de germen se han realizado en ratones de 21 días hasta 18 meses de edad. Cuando se realiza una ovariectomía donde es conveniente mantener la bursa ovárica intacta, se debe tener cuidado cuando incidiendo el tejido bursal. En los ratones mayores de seis meses de edad, gran parte de la bursa se convierte overlaid con la almohadilla de grasa, lo que limita las zonas que pueden utilizarse para el acceso. En estos casos, es a menudo ventajoso para…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Investigación en esta publicación fue apoyada por una generosa donación de ratones CBA hembra de 14 meses de edad del Instituto Nacional sobre el envejecimiento, de Colonia de roedores (Nancy Nadon) y por la Universidad del estado de Utah, escuela de medicina veterinaria, Departamento de animales, productos lácteos y Ciencias Veterinarias.
Materials
| Dissecting microscope | Any dissecting scope with an adjustable working distance. | ||
| Warm Water Recirculator and appropriate pad for your size surgical/recovery field. | Stryker/Gaymar | TP700 | Circulating water pads produce even and consistent temperature operating and recovery fields. |
| Surgical instruments-dissection instruments for access to the reproductive tract | Choice of specific surgical instruments is highly surgeon-specific | ||
| Surgical instruments-fine instruments for the transplantation procedure. | Choice of specific surgical instruments is highly surgeon-specific | ||
| Suture material for abdominal wall | eSutures | G3756K: 6-0 MILD CHROMIC GUT 18" HE-7 CUTTING, DOUBLE ARMED | |
| Suture material for ovarian bursa | eSutures | 2809G: 9-0 or 2810G: 10-0 ETHILON BLACK 5" BV130-5 TAPER | 10-0 suture can be difficult to locate if dropped on the surgery field. |
| Absorbable gelatin sponge | PFIZER. | Gelfoam- PFIZER 09-0315-08. | cut into small (~2mm) pieces under sterile conditions. |
| Staples for skin closure | Becton Dickinson | MikRon Autoclip 9mm (BD 427631) | |
| Eye ointment. | MWI Veterinary Supply Co. | Puralube sterile opthalmic ointment | |
| Syringes for anesthesia, analgesia and epinephrine | MWI Veterinary Supply Co. | BD 305536 | 27g x 3/8in,Intradermal Bevel 1/2ml |
| Syringes for saline. | MWI Veterinary Supply Co. | BD 309657. | 3ml syringe, luer-lok tip, 27g needle |
| Clippers/blade | Andis | Super AGR+™ Cordless Detachable Blade Clipper and a CeramicEdge® #40 blade. | Any clippers with a fine blade. |
| Ethanol | University chemical supply | dilute to 70% for use. | |
| Betadine solution | MWI Veterinary Supply Co. | 003233 | |
| 2×2 gauze pads | MWI Veterinary Supply Co. | 003073 | autoclaved with surgery packs |
| Borosilicate glass beads | Sigma-Aldrich Co. | Z273619 | Autoclave in sintilation vials |
| 4-vinylcyclohexene diepoxide | Sigma-Aldrich Co. | 94956 | |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich Co. | S3547 |
References
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