Пространственного и временного управления активации Т-клеток с помощью агонист Photoactivatable
Summary
Этот протокол описывает метод на основе изображений для активации Т-лимфоцитов с помощью photoactivatable пептид MHC, позволяя точный контроль пространственно-временных активации Т-клеток.
Abstract
Т-лимфоциты участвовать в быстрой, поляризованных сигналов, происходящие в течение нескольких минут после активации TCR. Это стимулирует формирование иммунологической синапса, стереотипных ячеек перекрестка, который регулирует активация Т-клеток и направленно целевых эффекторные реакции. Эффективно изучить эти процессы необходимо изображений подход, предназначена для захвата быстрый и поляризационные ответы. Этот протокол описывает такую систему, которая основана на photoactivatable пептид майор гистосовместимости комплекс (реализует), не стимулирующее, до тех пор, пока она подвергается воздействию ультрафиолетового света. Целевые decaging этого реагента во время videomicroscopy экспериментов позволяет точное управление пространственно-временных TCR активации и с высоким разрешением мониторинга последующих клеточных реакций на полного внутреннего отражения (TIRF) изображений. Этот подход также совместим с генетических и фармакологические возмущений стратегий. Это позволяет для Ассамблеи четко молекулярные пути, связывающие TCR сигнализации для формирования поляризованные цитоскелета структур, которые лежат в основе иммунологические синапса.
Introduction
Т-лимфоциты (Т-клетки) играют центральную роль в клеточный иммунитет, признав антигенные пептиды, отображаемые в контексте клеточной поверхности MHC. Антигены, которые при посредничестве TCR, диски дифференцировки клеток наивно T и способствует доставки коммуникативные и цитолитических ответов эффекторных населением. TCR участия также вызывает драматические изменения в сотовой архитектуры. В течение нескольких минут Т-клетки gloms на сторону антиген представляющих клеток (APC), образуя поляризованные интерфейс, известный как иммунологический синапса (IS)1,2. IS потенцирует ответы эффекторных клеток T, позволяя направленная релиз цитокинов или, в случае цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), литические белки, которые уничтожить БТР.
TCR участия реализует вызывает быстрое фосфорилирование несколько ниже по течению адаптер молекул, включая компоновщика для активации Т-клеток (LAT), которые в конечном итоге способствует надежной реконструкции синаптических цитоскелета2. Корковых нитчатые актина (F-миозина) диски Т-клеток, посыпка APC и затем распадается на кольцевые структуры, характеризуется F-актина накопления на периферии IS и истощение от центра. F-актина кольцо формирования тесно связана к переориентации организационного центра микротрубочек (КТВМ, также называется центросом в Т-клетки) в позицию непосредственно под центром интерфейса. Оба эти события происходят в течение нескольких минут первоначальных антигены и установить архитектурных контекст, в котором последующие активации событий и эффекторные реакции происходят.
Для изучения является формирование, различные лаборатории разработали подходы, в которых БТР заменяется на стеклянной поверхности, который содержит иммобилизованных TCR лигандами или поддерживает липидный бислой, что сама содержит лигандов3,4. Т-клетки формируют IS-подобных контактов на этих поверхностях, которые могут быть imaged полное внутреннее отражение флуоресцентным микроскопом (TIRF) или конфокальная микроскопия, позволяя высокого разрешения исследования ранних активация Т-клеток и формирования IS.
Хотя эти подходы позволили отличные визуализации полностью собранный есть, большая часть сигналов следующих лигирование TCR:pMHC происходит в течение нескольких секунд, осложняет усилия определить последовательность событий после активации TCR точно . Для обхода этой проблемы, был разработан photoactivation подход, в котором photoactivatable реализует используется для достижения пространственно-временных TCR активации5,6,7. В этой системе Т-клетки прикреплены к поверхности стекла, содержащие реализует photoactivatable, который не стимулирующий характер TCR пока облученных ультрафиолетового (УФ) света. УФ-облучения микрон размера региона поверхности под Т-клеток удаляет photocage, создание стимулирующей зоны, которые могут быть признаны Т-клеток. Последующие события сигнализации и цитоскелета ремоделирования затем контролируются с помощью генетически закодированный флуоресцентные журналистам. Две версии photoactivatable антигенные пептиды, моли цитохрома с88-103 (MCC) и овальбумина257-264 (OVA), которые представлены в контексте класса II MHC-Ek и класса я MHC H2-Kb, соответственно, были разработал (рис. 1). Это позволяет анализ обоих CD4+ T-клеток для MCC-Ek (выражая 5 C. C7, 2B4, или и TCRs) и CD8+ T-клеток для OVA-H2-Kb (выражения OT1 TCR).
За последнее десятилетие TCR photoactivation и изображений подход был использован установить точное кинетика раннего TCR сигнализации шаги, а также выявить молекулярные пути, регулирующие поляризованные цитоскелета ремоделирования5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. Например, assay сыграл важную роль в определении что Центросома переориентации к СВУ опосредуется локализованных градиент липидов второй посланник диацилглицерол центрирована на ИС. Предполагается, что эта методология будет продолжать быть ценным для приложений, которые требуют высокого разрешения изображений анализ функции Т-клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
В последние годы свет стала отличным инструментом для spatiotemporally контролируемых активацию клеточных процессов. Были разработаны различные методики, каждый с связанные преимущества и недостатки. В системе, описанной здесь, которая основана на decaging подвижности, внеклеточных лигандов, ид?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов в Huse лаборатории для консультаций и помощи. При поддержке США национальных институтов здравоохранения (R01-AI087644 для м.г.) и P30-CA008748 в Мемориал Слоан Kettering Рак центр.
Materials
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | Will be used to biotinylate proteins |
| Biotinylated Hb I-EK | For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Biotinylated NPE-MCC I-EK | Anaspec | Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated αH2-Kk antibody | BD Biosciences | 553591 | |
| Biotinylated NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated KAVY H2-Db | Anaspec | Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Hand held UV lamp | UVP | UVGL-25 | Lamp is held < 1 cm from the sample. 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF system. | Olympus | Additional information about the imaging system can be found in Figure 6 | |
| Mosaic digital diaphragm | Andor | ||
| Slidebook software | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the structure and function of the immunological synapse. Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).
- Liu, X., Huse, M. Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction. Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Dustin, M. Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers. Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).
- Chauveau, A., Le Floc’h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a., Huse, M. Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse. Sci. Signal. 7, ra82 (2014).
- Huse, M., et al. Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist. Immunity. 27, 76-88 (2007).
- Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells. Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).
- Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse. PLoS One. 9, 1-8 (2014).
- Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).
- Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells. Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).
- Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).
- Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).
- Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).
- Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).
- Nguyen Duc, T., Huse, M. A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors. ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).
- Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. Temporally precise in vivo control of intracellular signalling. Nature. 458, 1025-1029 (2009).
- Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
- Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).
- Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
- Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors. Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).
- Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).
- Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).
