Controllo spaziale e temporale di attivazione delle cellule T utilizzando un agonista fuse
Summary
Questo protocollo descrive un metodo basato su formazione immagine per attivare i linfociti T usando fuse peptide-MHC, consentendo un controllo preciso spazio-temporale dell’attivazione delle cellule T.
Abstract
Linfociti T impegnano nella segnalazione rapida, polarizzati, che si verificano pochi minuti dopo l’attivazione del TCR. Ciò induce la formazione di sinapsi immunologica, una giunzione cellulare stereotipato che regola l’attivazione delle cellule T e direzionalmente gli obiettivi le risposte effettrici. Per studiare questi processi in modo efficace, è necessario un approccio imaging che è su misura per catturare le risposte veloci, polarizzate. Questo protocollo descrive tale sistema, che si basa su un fuse peptide-major istocompatibilità (pMHC) che è non-stimolatore fino a quando è esposto a luce ultravioletta. Decaging mirati di questo reagente durante gli esperimenti di videomicroscopia consente controllo preciso spazio-temporale dell’attivazione di TCR e monitoraggio ad alta risoluzione delle successive risposte cellulari di riflessione interna totale (TIRF) imaging. Questo approccio è anche compatibile con le strategie di perturbazione genetici e farmacologici. In questo modo per il montaggio delle vie molecolari ben definite che collegano TCR segnalazione alla formazione delle strutture citoscheletriche polarizzate che sottendono la sinapsi immunologica.
Introduction
Linfociti T (cellule T) gioca un ruolo centrale nell’immunità cellulare riconoscendo peptidi antigenici visualizzate nel contesto della superficie cellulare MHC. Riconoscimento dell’antigene, che è mediata dal TCR, spinge la differenziazione delle cellule T naive e promuove la consegna delle risposte citolitiche e comunicative di effettori. Impegno di TCR inoltre induce cambiamenti drammatici nell’architettura cellulare. In pochi minuti, le cellule T gloms sul lato della cella presentanti l’antigene (APC), formando un’interfaccia polarizzata, conosciuta come la sinapsi immunologica (IS)1,2. L’IS rafforza le risposte delle cellule T effettrici abilitando il direzionale rilascio di citochine o, nel caso dei linfociti T citotossici (CTL), proteine litiche che distruggono l’APC.
Impegno di TCR di pMHC induce la fosforilazione rapida di più molecole di adattatore a valle, compreso il Linker per le celle di attivazione di T (LAT), che in definitiva promuove robusto rimodellamento del citoscheletro sinaptica2. Corticale actina filamentosa (F-actina) unità delle cellule di T di diffusione sopra la superficie APC e poi si risolve in una struttura anulare caratterizzata da accumulo di F-actina alla periferia IS e svuotamento dal centro. Formazione di anello di F-actina è strettamente per il riorientamento del centro organizzatore dei microtubuli (MTOC, chiamato anche il centrosoma in cellule di T) ad una posizione appena sotto il centro dell’interfaccia. Entrambi gli eventi si verificano all’interno di minuti di riconoscimento iniziale dell’antigene e stabilire il contesto architettonico in cui gli eventi di attivazione successiva ed effettrici si ottiene una risposta.
Per studiare la formazione di IS, vari laboratori hanno sviluppato approcci in cui la APC è sostituito da una superficie di vetro che contiene immobilizzato TCR ligandi o supporta un bilayer del lipido che a sua volta contiene i ligandi3,4. T cellule formano IS-come contatti su queste superfici che possono essere imaged di microscopio a fluorescenza riflessione interna totale (TIRF) o microscopia confocale, permettendo studi ad alta risoluzione di attivazione delle cellule T iniziale e la formazione di IS.
Sebbene questi approcci hanno permesso per visualizzazione eccellente del è completamente assemblato, gran parte della legatura TCR:pMHC seguente segnalazione si verifica in pochi secondi, che complica gli sforzi per determinare la sequenza degli eventi che seguono l’attivazione TCR con precisione . Per ovviare a questo problema, è stato sviluppato un approccio di fotoattivazione, in cui fuse pMHC viene utilizzato per realizzare il controllo spazio-temporale di TCR attivazione5,6,7. In questo sistema, le cellule T sono attaccate alle superfici di vetro contenente pMHC di fuse che è non-stimolatori per il TCR, fino a quando irradiato con luce ultravioletta (UV). Irradiazione UV di una regione di graduate micron della superficie sotto la cellula T rimuove il photocage creando una zona di stimolatorio che possa essere riconosciuta dalle cellule T. Eventi successivi di segnalazione e il rimodellamento del citoscheletro sono quindi monitorati utilizzando reporter fluorescenti geneticamente codificato. Due versioni di fuse di peptidi antigenici, lepidottero del citocromo c88-103 (MCC) e ovoalbumina257-264 (OVA), che vengono presentati nel contesto della classe II MHC-Ek e la classe I di MHC H2-Kb, rispettivamente, sono stati sviluppato (Figura 1). Questo permette l’analisi di entrambi CD4+ T cellule specifiche per MCC-I-Ek (esprimendo il 5 C. C7, 2B4, o AND TCR) e CD8+ T cellule specifiche per OVA-H2-Kb (che esprimono TCR OT1).
Nell’ultimo decennio, l’approccio di fotoattivazione e formazione immagine di TCR è stata utilizzata per stabilire la precisa cinetica di TCR primi passi di segnalazione e anche per identificare i meccanismi molecolari che regolano polarizzata in rimodellamento del citoscheletro5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. ad esempio, il dosaggio è stato strumentale nel determinare tale centrosoma riorientamento verso l’APC è mediato da una sfumatura localizzata del lipido secondo messaggero diacilglicerolo centrato presso l’IS. Si prevede che questa metodologia continuerà ad essere prezioso per applicazioni che richiedono analisi di imaging ad alta risoluzione della funzione delle cellule T.
Protocol
Representative Results
Discussion
Negli ultimi anni, la luce è emerso come un ottimo strumento per l’attivazione spatiotemporally controllata dei processi cellulari. Sono state sviluppate varie metodologie, ciascuno con associati vantaggi e svantaggi. Il sistema descritto qui, che è basato su decaging di ligandi extracellulari, immobilizzati, è ideale per l’analisi delle risposte di segnalazione rapide, subcellulare, polarizzate. Questo approccio è stato applicato per esaminare è formazione in cellule di T, come descritto in precedenza. Inoltre, son…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio Huse per consulenza e assistenza. Supportato da l’US National Institutes of Health (R01-AI087644 di M.H.) e P30-CA008748 al Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
Materials
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | Will be used to biotinylate proteins |
| Biotinylated Hb I-EK | For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Biotinylated NPE-MCC I-EK | Anaspec | Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated αH2-Kk antibody | BD Biosciences | 553591 | |
| Biotinylated NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated KAVY H2-Db | Anaspec | Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Hand held UV lamp | UVP | UVGL-25 | Lamp is held < 1 cm from the sample. 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF system. | Olympus | Additional information about the imaging system can be found in Figure 6 | |
| Mosaic digital diaphragm | Andor | ||
| Slidebook software | Intelligent Imaging Innovations |
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