Summary

Contrôle spatial et temporel de l’Activation des cellules T à l’aide d’un agoniste Photoactivatable

Published: April 25, 2018
doi:

Summary

Ce protocole décrit une méthode basée sur l’imagerie pour activer les lymphocytes T à l’aide de photoactivatable peptide-MHC, permettant un contrôle précis spatio-temporelle de l’activation des cellules T.

Abstract

Lymphocytes T engagent rapide, polarisée de signalisation, survenant dans les minutes suivant l’activation de TCR. Cela induit la formation de la synapse immunologique, une jonction cellule-cellule stéréotypés qui régule l’activation des cellules T et les cibles directionnellement réponses effectrices. Pour étudier efficacement ces processus, il faut une approche d’imagerie adaptée afin de pouvoir saisir les réponses rapides, polarisées. Ce protocole décrit un tel système, qui repose sur une photoactivatable peptide-major complexe d’histocompatibilité (SPHL) qui est non-stimulateur jusqu’à ce qu’elle est exposée aux rayons ultraviolets. Decaging ciblée de ce réactif au cours d’expériences de vidéomicroscopie permet un contrôle précis spatio-temporelle de l’activation de TCR et surveillance haute résolution des réponses cellulaires ultérieures par réflexion totale interne (FRBR) d’imagerie. Cette approche est également compatible avec les stratégies de perturbations génétiques et pharmacologiques. Cela permet l’assemblage des voies moléculaires bien définis qui relient le TCR de signalisation à la formation des structures du cytosquelette polarisées qui sous-tendent la synapse immunologique.

Introduction

Les lymphocytes T (cellules T) jouent un rôle central dans l’immunité cellulaire en reconnaissant les peptides antigéniques affichées dans le contexte de la surface de la cellule MHC. Reconnaissance de l’antigène, qui est véhiculée par le TCR, entraîne la différenciation des cellules naïves T et fait la promotion de la fourniture de réponses cytolytiques et communicatifs par les populations de l’effecteur. Engagement de TCR induit également des changements dramatiques dans l’architecture cellulaire. En quelques minutes, les cellules T gloms sur le côté de la cellules présentatrices d’antigène (APC), formant une interface polarisée appelée la synapse immunologique (IS)1,2. L’IS potentialise les réponses effectrices des lymphocytes T en permettant la sortie directionnelle des cytokines ou, dans le cas de lymphocytes T cytotoxiques (CTL), des protéines lytiques qui détruisent l’APC.

Engagement de TCR par SPHL induit la phosphorylation rapide de plusieurs molécules d’adaptateur en aval, y compris l’éditeur de liens pour l’Activation des cellules T (LAT), qui favorise en fin de compte robuste remodelage du cytosquelette synaptique2. Filaments d’actine cortical (actine-F) pousse les lymphocytes T s’étendant sur la surface de l’APC et puis il résout en une structure annulaire caractérisée par l’accumulation de F-actine à la périphérie de l’IS et l’appauvrissement de la couche du centre. Formation d’actine F anneau est étroitement couplée à une réorientation du centre organisateur de microtubules (MTOC, également appelée centrosome dans les lymphocytes T) à un poste juste en dessous du centre de l’interface. Les deux événements se produisent dans les minutes suivant la reconnaissance de l’antigène initial et établissent le contexte architectural dans lequel les événements d’activation ultérieure et effectrices réponses se produisent.

Pour étudier la formation IS, différents laboratoires ont mis au point des approches dont l’APC est remplacé par une surface de verre qui contient immobilisée TCR ligands ou prend en charge une bicouche lipidique que lui-même contienne les ligands3,4. Les lymphocytes T forment IS-comme contacts sur ces surfaces qui peuvent être photographiées par microscope à fluorescence réflexion totale interne (FRBR) ou microscopie confocale, permettant des études à haute résolution d’activation des cellules T et formation IS.

Bien que ces approches ont permis pour l’excellente visualisation de l’IS entièrement assemblé, une grande partie de la signalisation de la ligature TCR:pMHC suivante se produit quelques secondes, ce qui complique les efforts pour déterminer la séquence des événements après l’activation de la TCR avec précision . Pour contourner ce problème, une approche de photoactivation a élaboré, dans lequel photoactivatable SPHL est utilisé pour obtenir un contrôle spatio-temporelle du TCR activation5,6,7. Dans ce système, les cellules T sont attachés aux surfaces de verre contenant la SPHL photoactivatable qui est non-stimulateur pour le TCR jusqu’à irradié par la lumière ultraviolette (UV). L’irradiation UV d’une région de microns de taille de la surface sous la cellule T supprime la photocage création d’une zone de stimulation qui peut être reconnue par les lymphocytes T. Les événements ultérieurs de signalisation et le remodelage du cytosquelette sont contrôlés puis à l’aide de reporters fluorescents génétiquement encodés. Deux versions de photoactivatable de peptides antigéniques, lépidoptère du cytochrome c88-103 (MCC) et l’ovalbumine257-264 (OVA), qui sont présentés dans le contexte de la classe II de MHC I-Ek et de la classe I de MHC H2-Kb, respectivement, ont été développés (Figure 1). Cela permet l’analyse des deux CD4+ T des cellules spécifiques pour MCC-je-Ek (exprimant la 5C. C7, 2 b 4, ou AND TCRs) et CD8+ T des cellules spécifiques d’ovules-H2-Kb (exprimant le TCR OT1).

Ces dix dernières années, l’approche de photoactivation et imagerie de TCR a été utilisé pour établir la cinétique précise TCR premières étapes de la signalisation et aussi d’identifier les voies moléculaires qui régissent le remodelage du cytosquelette polarisée5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. par exemple, le test a joué un rôle important dans la détermination de cette centrosome réorientation vers l’APC est médiée par un gradient localisé de lipides deuxième messager diacylglycérol centré à l’IS. Il est prévu que cette méthodologie continueront d’être précieux pour des applications exigeant une analyse d’imagerie à haute résolution de la fonction des cellules T.

Protocol

1. préparation des Surfaces vitrées stimulateur Manteau huit puits chambré compartimentée avec biotinylé poly-L-lysine (Bio-PLL) dilué à 1/500 dans l’eau distillée, déminéralisée (ddH2O). Incuber 30 min à température ambiante (RT). Laver avec H2O. Sec pendant 2 h à température ambiante. Bloc Bio-PLL enduit les surfaces avec un tampon de blocage (HEPES salin [10 mM HEPES pH 7,4, NaCl 150 mM], avec 2 % de BSA) pendant 30 min à température ambi…

Representative Results

L’approche de photoactivation et imagerie permet d’observation et quantification facile des réponses signalisation rapides, polarisées. Pour illustrer ses capacités, reproduites ici est une expérience examinant la corrélation spatio-temporelle entre l’accumulation induite par le TCR DAG et réorientation du centrosome. 5 C. Explosions de cellule C7 T ont été retrovirally transduites avec deux reporters fluorescents : un biocapteur DAG contenant les domaines de C1 en tandem d…

Discussion

Ces dernières années, la lumière a émergé comme un excellent outil pour activation spatio-temporelle contrôlée des processus cellulaires. Diverses méthodes ont été développées, chacune avec les inconvénients et les avantages associés. Le système décrit ici, qui repose sur la decaging des ligands immobilisés, extracellulaires, est parfaitement adapté pour l’analyse des réponses de signalisation rapides, subcellulaires, polarisées. Cette approche a été appliquée afin d’examiner la formation IS da…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les membres du laboratoire Huse de conseils et d’assistance. Soutenu par les US National Institutes of Health (R01-AI087644 à M.H.) et P30-CA008748 au Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.

Materials

Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermofischer Scientific 155361
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P2636 Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
EZ-Link NHS-Biotin Thermofischer Scientific 20217 Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
Streptavidin Thermofischer Scientific 434301
BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit Avidity BirA500 Will be used to biotinylate proteins
Biotinylated Hb I-E For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit
Biotinylated NPE-MCC I-E Anaspec Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated αH2-Kk antibody BD Biosciences 553591
Biotinylated NPE-OVA H2-Kb Anaspec Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated KAVY H2-Db  Anaspec Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec
Biotinylated ICAM1  For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit
Hand held UV lamp UVP UVGL-25 Lamp is held < 1 cm from the sample.  30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.
Olympus IX-81 OMAC TIRF system. Olympus Additional information about the imaging system can be found in Figure 6
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Cite This Article
Sanchez, E., Huse, M. Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist. J. Vis. Exp. (134), e56655, doi:10.3791/56655 (2018).

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