एक Photoactivatable एगोनिस्ट का उपयोग कर टी सेल सक्रियण के स्थानिक और लौकिक नियंत्रण
Summary
यह प्रोटोकॉल टी सेल सक्रियण के सटीक spatiotemporal नियंत्रण को सक्षम करने, photoactivatable पेप्टाइड-MHC का उपयोग कर टी लिम्फोसाइटों को सक्रिय करने के लिए एक इमेजिंग-आधारित पद्धति का वर्णन करता है ।
Abstract
टी लिम्फोसाइटों तेजी से, ध्रुवीय संकेतन में संलग्न हैं, TCR सक्रियण के बाद मिनट के भीतर होने वाली । यह प्रतिरक्षा synapse, एक छवि कक्ष-सेल जंक्शन है कि टी सेल सक्रियण और दिशाहीन लक्ष्य प्रभाव प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करता है के गठन लाती है । इन प्रक्रियाओं को प्रभावी ढंग से अध्ययन करने के लिए, एक इमेजिंग दृष्टिकोण है कि तेजी से कब्जा करने के लिए सिलवाया है, ध्रुवीकरण प्रतिक्रियाओं आवश्यक है । यह प्रोटोकॉल ऐसी प्रणाली का वर्णन करता है, जो एक photoactivatable पेप्टाइड-प्रमुख histocompatibility कॉम्प्लेक्स (pMHC) पर आधारित होती है जो पराबैंगनी प्रकाश के संपर्क में आने तक गैर-stimulatory है. लक्षित decaging videomicroscopy प्रयोगों के दौरान इस एजेंट के TCR सक्रियण और अनुवर्ती सेलुलर प्रतिक्रियाओं के उच्च-रिज़ॉल्यूशन निगरानी की सटीक spatiotemporal नियंत्रण द्वारा कुल आंतरिक प्रतिबिंब (TIRF) इमेजिंग सक्षम करता है । यह दृष्टिकोण भी आनुवंशिक और औषधीय गड़बड़ी रणनीतियों के साथ संगत है । यह अच्छी तरह से परिभाषित आणविक रास्ते के विधानसभा के लिए अनुमति देता है कि TCR ध्रुवीकरण cytoskeletal संरचनाओं कि आबाद प्रतिरक्षा synapse के गठन के लिए संकेतन लिंक ।
Introduction
टी लिम्फोसाइटों (टी कोशिकाओं) सेल सतह MHC के संदर्भ में प्रदर्शित प्रतिजनी पेप्टाइड्स पहचानने से सेलुलर प्रतिरक्षा में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं । प्रतिजन मांयता है, जो TCR द्वारा मध्यस्थता है, भोली टी कोशिकाओं के भेदभाव ड्राइव और cytolytic और प्रभाव आबादी द्वारा संचार प्रतिक्रियाओं के वितरण को बढ़ावा देता है । TCR सगाई भी सेलुलर वास्तुकला में नाटकीय परिवर्तन लाती है । मिनट के भीतर, टी कोशिकाओं प्रतिजन के पक्ष पर gloms-प्रस्तुत सेल (APC), एक ध्रुवीय प्रतिरक्षा synapse (है) के रूप में जाना जाता इंटरफेस बनाने1,2। साइटोकिंस के दिशात्मक रिलीज को सक्षम करने या, साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों (CTLs), lytic प्रोटीन है कि APC नष्ट करने के मामले में द्वारा potentiates टी सेल प्रभाव प्रतिक्रियाओं है ।
pMHC द्वारा TCR सगाई कई बहाव अनुकूलक अणुओं की तेजी से फास्फारिलीकरण, टी कोशिकाओं के सक्रियकरण के लिए लिंक सहित (अक्षांश), जो अंततः मजबूत synaptic cytoskeleton के remodeling को बढ़ावा देता है लाती है 2 । Cortical रेशा actin (एफ actin) ड्राइव टी APC सतह पर फैल सेल, और फिर एक कुंडलाकार में एफ-actin संचय द्वारा विशेषता संरचना में हल करता है परिधि और केंद्र से कमी है । एफ actin अंगूठी गठन कसकर microtubule आयोजन केंद्र (MTOC, भी टी कोशिकाओं में centrosome कहा जाता है) के उंमुखीकरण के लिए युग्मित है बस अंतरफलक के केंद्र के नीचे एक स्थिति के लिए । दोनों ईवेंट्स प्रारंभिक antigen पहचान के मिनट के भीतर हो और जिसमें क्रमिक सक्रियण ईवेंट्स और प्रभाव प्रतिसाद हो वास्तु प्रसंग स्थापित करें ।
अध्ययन करने के लिए, विभिंन प्रयोगशालाओं दृष्टिकोण है जिसमें APC एक कांच की सतह है कि या तो शामिल मैटीरियल TCR लाइगैंडों है या एक लिपिड bilayer है कि खुद लाइगैंडों3,4शामिल का समर्थन करता है की जगह है विकसित किया है । टी कोशिकाओं के रूप में इन सतहों कि कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (TIRF) या फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged किया जा सकता है पर संपर्कों की तरह है, जल्दी टी सेल सक्रियण के उच्च संकल्प अध्ययन को सक्षम करने और गठन है ।
हालांकि इन तरीकों को पूरी तरह से इकट्ठे के उत्कृष्ट दृश्य के लिए अनुमति दी है, TCR निंनलिखित संकेत के बहुत: pMHC बंधाव सेकंड के भीतर होता है, TCR सक्रियण के बाद की घटनाओं के अनुक्रम का निर्धारण सही प्रयास उलझी . इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए एक photoactivation दृष्टिकोण विकसित किया गया है, जिसमें photoactivatable pMHC को TCR सक्रियण5,6,7का spatiotemporal नियंत्रण प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस प्रणाली में, टी कोशिकाओं कांच सतहों photoactivatable pMHC युक्त है कि गैर है stimulatory पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के साथ विकिरणित तक TCR के लिए संलग्न हैं । टी सेल के नीचे सतह के एक माइक्रोन आकार क्षेत्र के यूवी विकिरण एक stimulatory क्षेत्र है कि टी सेल द्वारा मांयता प्राप्त किया जा सकता है बनाने photocage निकालता है । बाद संकेतन घटनाओं और cytoskeletal remodeling तो आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट पत्रकारों का उपयोग कर निगरानी कर रहे हैं । दो photoactivatable के संस्करण एंटीजन पेप्टाइड्स, मोठ cytochrome सी88-103 (एमसीसी) और ovalbumin257-264 (ओवा), जो कक्षा द्वितीय MHC i-Ek और वर्ग i MHC H2-kbके सन्दर्भ में प्रस्तुत किए गए हैं, क्रमशः विकसित (चित्र 1) । यह दोनों CD4+ टी एमसीसी-I-Ek (5C व्यक्त करने के लिए विशिष्ट कोशिकाओं के विश्लेषण में सक्षम बनाता है । C7, 2B4, या और TCRs) और सीडी 8 + टी कोशिकाओं के लिए विशिष्ट ओवा-H2-K b (OT1 TCR व्यक्त करना).
पिछले एक दशक से अधिक, TCR photoactivation और इमेजिंग दृष्टिकोण को जल्दी TCR संकेतन कदम की सटीक कैनेटीक्स स्थापित करने के लिए उपयोग किया गया है और भी आणविक रास्ते की पहचान करने के लिए ध्रुवीकरण cytoskeletal remodeling5, ६ , 7 , 8 , 9 , 10. उदाहरण के लिए, परख का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी कि APC की ओर centrosome उंमुखीकरण लिपिड दूसरा दूत diacylglycerol के एक स्थानीयकृत ढाल द्वारा मध्यस्थता है पर केंद्रित है । यह प्रत्याशित है कि इस पद्धति के अनुप्रयोगों के लिए मूल्यवान है कि मांग उच्च टी सेल समारोह के संकल्प इमेजिंग विश्लेषण जारी रहेगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हाल के वर्षों में, प्रकाश सेलुलर प्रक्रियाओं के spatiotemporally नियंत्रित सक्रियण के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण के रूप में उभरा है । विभिंन तरीकों से विकसित किया गया है, जुड़े लाभ और नुकसान के साथ प्रत्येक । यहां वर्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सलाह और सहायता के लिए हुँसे लैब के सदस्यों को धंयवाद । स्वास्थ्य के अमेरिका के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित (R01-AI087644 को M.H. और P30-CA008748 को मेमोरियल Sloan-Kettering कैंसर सेंटर).
Materials
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | Will be used to biotinylate proteins |
| Biotinylated Hb I-EK | For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Biotinylated NPE-MCC I-EK | Anaspec | Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated αH2-Kk antibody | BD Biosciences | 553591 | |
| Biotinylated NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated KAVY H2-Db | Anaspec | Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Hand held UV lamp | UVP | UVGL-25 | Lamp is held < 1 cm from the sample. 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF system. | Olympus | Additional information about the imaging system can be found in Figure 6 | |
| Mosaic digital diaphragm | Andor | ||
| Slidebook software | Intelligent Imaging Innovations |
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