Romlige og tidsmessige kontroll av T celle aktivering ved hjelp av en Photoactivatable Agonist
Summary
Denne protokollen beskriver en imaging-basert metode for å aktivere T-lymfocytter med photoactivatable peptid-MHC, muliggjør nøyaktig spatiotemporal kontroll av T celle aktivering.
Abstract
T-lymfocytter engasjere seg i rask, polariserte signalnettverk, innenfor minuttene etter TCR aktivisering. Dette medfører dannelsen av immunologiske synapse, et stereotype celle-celle veikryss som regulerer T celle aktivering og directionally mål effektor svar. For å studere disse prosessene effektivt, er tenkelig tilnærming som er skreddersydd til fange rask, polariserte svar nødvendig. Denne protokollen beskriver et slikt system, som er basert på en photoactivatable peptid-major histocompatibility complex (pMHC) det er ikke-stimulerende til det utsettes for ultrafiolett lys. Målrettet decaging av denne reagensen under videomicroscopy eksperimenter kan nøyaktig spatiotemporal kontroll av TCR aktivisering og høy oppløsning overvåkning av etterfølgende mobilnettet svar av total intern refleksjon (TIRF) imaging. Denne tilnærmingen er også kompatibel med genetiske og farmakologiske forstyrrelsene strategier. Dette muliggjør montering av veldefinerte molekylær trasé som kobler TCR signalisering til dannelsen av polarisert cellen cytoskjelett strukturer underlie immunologiske synapse.
Introduction
T-lymfocytter (T celler) spille en sentral rolle i cellulære immunitet ved å anerkjenne antigen peptider vises i forbindelse med celleoverflaten MHC. Antigen anerkjennelse, som er formidlet av TCR, kjører differensiering av naiv T celler og fremmer levering av cytolytic og kommunikative svar av effektor populasjoner. TCR engasjement også induserer dramatiske endringer i mobilnettet arkitektur. Minutter gloms T-celler ved siden av antigen-presentasjon celle (APC), danner en polarisert grensesnitt kalles immunologiske synapse (IS)1,2. ER potentiates T-celler effektor svar ved å aktivere retningsbestemt utgivelsen av cytokiner eller, i tilfelle cytotoksiske T-lymfocytter (CTLer), lytisk proteiner som ødelegger APC.
TCR engasjement fra pMHC induserer den raske fosforylering av flere nedstrøms adapter molekyler, inkludert Linker for aktivering av T-celler (LAT), som til slutt fremmer robust remodeling av synaptic cytoskjelett2. Kortikale trådformede utgangen (F-utgangen) stasjoner T celle spredning over APC overflaten og deretter løser til et ringformet struktur preget av F-utgangen akkumulering er periferi og nedbryting fra sentrum. F-utgangen ring formasjon er tett koblet til omleggingen av microtubule organisere sentrum (MTOC, også kalt centrosome i T celler) til en plassering like under midten av grensesnittet. Begge hendelsene oppstår innen minuttene av første antigen anerkjennelse og etablere arkitektoniske konteksten der etterfølgende aktivisering hendelser og effektor svar oppstår.
For å studere er formasjon, har ulike labs utviklet metoder som APCs bærbare er erstattet av en glassoverflate som inneholder immobilisert TCR ligander eller støtter en lipid bilayer at selv inneholder ligander3,4. T celler utgjør er som kontakter på disse overflater som kan avbildes totale interne refleksjon fluorescens mikroskopet (TIRF) eller AC confocal mikroskopi, aktivere høyoppløselig studier av tidlig T celle aktivering og er dannelse.
Selv om disse metodene har tillatt for utmerket visualisering av ferdigmonterte er, oppstår mye av den signalnettverk følgende TCR:pMHC ligation innen sekunder, kompliserer innsats som avgjør rekkefølgen av hendelser etter TCR aktivisering nøyaktig . For å omgå dette problemet, er en photoactivation tilnærming utviklet, der photoactivatable pMHC brukes til å oppnå spatiotemporal kontroll av TCR aktivisering5,6,7. I dette systemet, er T-celler knyttet til glassflater inneholder photoactivatable pMHC som er ikke-stimulerende til TCR til bestrålt med ultrafiolett (UV) lys. UV bestråling av en mikron størrelse regionen overflaten under T cellen fjerner photocage skaper en stimulerende sone som kan gjenkjennes av T cellen. Påfølgende signalnettverk hendelser og cellen cytoskjelett remodeling overvåkes deretter bruke genetisk kodet fluorescerende journalister. To photoactivatable versjoner av antigen peptider, møll cytochrome c88-103 (MCC) og ovalbumin257-264 (OVA), som presenteres i sammenheng med klassen II MHC-Ek og klassen jeg MHC H2-Kb, henholdsvis, er utviklet (figur 1). Dette gjør at analyse av både CD4+ T celler spesifikke for MCC-jeg-Ek (uttrykke den 5 C. C7, 2B4, eller og TCRs) og CD8+ T celler spesifikke for OVA-H2-Kb (uttrykke OT1 TCR).
Det siste tiåret, har TCR photoactivation og bildebehandling tilnærming vært utnyttet å etablere den presise kinetics av tidlig TCR signalering trinn og også identifisere molekylær veiene gjelder polarisert cellen cytoskjelett remodeling5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. For eksempel analysen var medvirkende i å bestemme at centrosome nyorientering mot APC er formidlet av lokaliserte gradering av lipid andre messenger diacylglycerol sentrert på er. Det er forventet at denne metodikken vil fortsette å være verdifulle for programmer som krever høy-resolution tenkelig analyse av T celle-funksjonen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De siste årene, har lys dukket opp som et utmerket verktøy for spatiotemporally kontrollert aktivering av mobilnettet prosesser. Ulike metoder har blitt utviklet, med tilhørende fordeler og ulemper. Systemet beskrevet her, som er basert på decaging av immobilisert, ekstracellulære ligander, er ideelt for analyse av rask, subcellular, polarisert signalnettverk svar. Denne tilnærmingen er brukt for å undersøke er formasjon i T-celler som beskrevet ovenfor. I tillegg har bur ligander for andre reseptorer blitt utvik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer av feriehus laboratoriet råd og hjelp. Støttet av de amerikanske National instituttene of Health (R01-AI087644 til M.H.) og P30-CA008748 til Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
Materials
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | Will be used to biotinylate proteins |
| Biotinylated Hb I-EK | For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Biotinylated NPE-MCC I-EK | Anaspec | Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated αH2-Kk antibody | BD Biosciences | 553591 | |
| Biotinylated NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated KAVY H2-Db | Anaspec | Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Hand held UV lamp | UVP | UVGL-25 | Lamp is held < 1 cm from the sample. 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF system. | Olympus | Additional information about the imaging system can be found in Figure 6 | |
| Mosaic digital diaphragm | Andor | ||
| Slidebook software | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the structure and function of the immunological synapse. Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).
- Liu, X., Huse, M. Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction. Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Dustin, M. Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers. Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).
- Chauveau, A., Le Floc’h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a., Huse, M. Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse. Sci. Signal. 7, ra82 (2014).
- Huse, M., et al. Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist. Immunity. 27, 76-88 (2007).
- Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells. Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).
- Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse. PLoS One. 9, 1-8 (2014).
- Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).
- Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells. Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).
- Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).
- Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).
- Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).
- Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).
- Nguyen Duc, T., Huse, M. A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors. ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).
- Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. Temporally precise in vivo control of intracellular signalling. Nature. 458, 1025-1029 (2009).
- Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
- Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).
- Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
- Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors. Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).
- Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).
- Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).
