Rumsliga och tidsmässiga kontroll av T-cellsaktivering med hjälp av en Photoactivatable-Agonist
Summary
Det här protokollet beskriver en imaging-baserad metod för att aktivera T-lymfocyter som använder photoactivatable peptid-MHC, möjliggör exakt spatiotemporal kontroll av T-cellsaktivering.
Abstract
T-lymfocyter engagera sig i snabb, polariserade signalering, som uppträder inom minuter efter TCR aktivering. Detta inducerar bildandet av immunologisk synaps, en stereotyp cell-cell korsningen som reglerar T cellaktivering och directionally mål effektor svaren. För att studera dessa processer effektivt, krävs en tänkbar strategi som är anpassad till fånga snabb, polariserade svaren. Det här protokollet beskriver ett sådant system, som bygger på en photoactivatable peptid-major histocompatibility complex (pMHC) som är icke-stimulerande tills det utsätts för ultraviolett ljus. Riktade decaging av denna reagens under videomicroscopy experiment möjliggör exakt spatiotemporal kontroll av TCR aktivering och högupplösta övervakning av efterföljande cellulära svar av Totalreflexion (Frida) imaging. Detta tillvägagångssätt är också kompatibel med genetiska och farmakologiska störning strategier. Detta möjliggör montering av väldefinierade molekylära vägar som länkar TCR signalering till bildandet av de polariserade cytoskeletal strukturer som ligger bakom immunologisk synaps.
Introduction
T-lymfocyter (T-celler) spelar en central roll i cellulär immunitet genom att erkänna antigen peptider visas i samband med cellytan MHC. Antigen erkännande, som medieras av TCR, driver differentiering av naiva T-celler och främjar leverans av cytolytisk och kommunikativa svar av effektor populationer. TCR interaktion inducerar också dramatiska förändringar i cellulära arkitektur. Inom minuter gloms T-cellerna på sidan av den antigen-presenterande cellen (APC), bildar en polariserad gränssnitt som kallas immunologisk synaps (IS)1,2. IS förstärker T cell effector Svaren genom att aktivera riktad frisläppandet av cytokiner eller, när det gäller cytotoxiska T-lymfocyter (CTL), lytisk proteiner som förstör APC.
TCR interaktion av pMHC inducerar den snabba fosforyleringen av flera nedströms adapter molekyler, inklusive Linker för aktivering av T-cellerna (LAT), som i slutändan främjar robust remodeling av synaptic cytoskelettet2. Kortikala fintrådiga aktin (F-aktin) driver T cell spridning över APC ytan, och sedan löser in en ringformig struktur som kännetecknas av F-aktin ackumulering vid IS periferi och utarmning från centrum. F-aktin ring bildandet är tätt kopplade till reorientationen av mikrotubuli organisera center (MTOC, även kallad centrosome i T-celler) till en position strax under mitten av gränssnittet. Båda händelserna inträffar inom minuter om inledande antigen erkännande och upprätta det arkitektoniska sammanhang i vilka efterföljande aktivering händelser och effektor Svaren används.
För att studera är bildning, har olika labs utvecklat metoder som APC ska ersättas med en glasyta som antingen innehåller immobiliserade TCR ligander eller stöder en lipid lipidens att själv innehåller ligander3,4. T-celler bildar IS-liknande kontakter på dessa ytor som kan avbildas av totalreflexion fluorescens Mikroskop (Frida) eller konfokalmikroskopi, aktivera högupplösta studier av tidig T cellaktivering och IS bildas.
Även om dessa metoder har tillåtit för utmärkt visualisering av färdigmonterad är, sker mycket av den signalering följande TCR:pMHC ligation inom sekunder, komplicerande ansträngningar för att fastställa händelseförloppet efter TCR aktiveringen exakt . För att kringgå problemet, har en ljusaktivering strategi utvecklats, där photoactivatable pMHC används för att uppnå spatiotemporal kontroll av TCR aktiveringen5,6,7. I detta system, är T-celler kopplade till glasytor som innehåller photoactivatable pMHC som är icke-stimulerande till TCR tills bestrålas med ultraviolett (UV) ljus. UV-bestrålning av en micron storlek region av ytan under den T-cellen tar bort den photocage att skapa en stimulerande zon som kan kännas igen av T-cellen. Efterföljande signalering händelser och cytoskeletal remodeling övervakas sedan använder genetiskt kodade fluorescerande reportrar. Två photoactivatable versioner av antigena peptider, moth cytokrom c88-103 (MCC) och äggalbumin257-264 (ägg), som presenteras i samband med klassen II MHC-Ek och klassen jag MHC H2-Kb, respektive, har varit utvecklade (figur 1). Detta gör analysen av både CD4+ T-celler specifika för MCC-jag-EKarlsson (som uttrycker den 5 C. C7, 2B4, eller och TCRs) och CD8+ T-celler specifika för ägg-H2-Kb (som uttrycker OT1 TCR).
Under det senaste decenniet, har en TCR ljusaktivering och imaging strategi utnyttjats att upprätta precisa kineticsen av tidig TCR signalering steg och också att identifiera de molekylära vägar som reglerar polariserade cytoskeletal remodeling5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. till exempel analysen var instrumental i att fastställa att centrosome omorientering mot APC medieras av en lokaliserad gradient av de lipid andra messenger diglyceridolja centrerad på IS. Det förväntas att denna metod kommer att vara värdefullt för program som kräver hög upplösning imaging analys av T-cellsfunktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under de senaste åren har ljus vuxit fram som ett utmärkt verktyg för spatiotemporally kontrollerade aktivering av cellulära processer. Olika metoder har utvecklats, med tillhörande fördelar och nackdelar. Systemet beskrivs här, som är baserad på den decaging av immobiliserade, extracellulär ligander, är idealiskt lämpad för analys av snabba, subcellulär, polariserade signalering svaren. Detta synsätt har tillämpats för att undersöka IS bildas i T-celler som beskrivs ovan. Dessutom har bur ligander för…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmar i Huse lab för råd och hjälp. Stöds av de amerikanska National institutionerna of Health (R01-AI087644 till M.H.) och P30-CA008748 till Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
Materials
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | Will be used to biotinylate proteins |
| Biotinylated Hb I-EK | For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Biotinylated NPE-MCC I-EK | Anaspec | Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated αH2-Kk antibody | BD Biosciences | 553591 | |
| Biotinylated NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated KAVY H2-Db | Anaspec | Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Hand held UV lamp | UVP | UVGL-25 | Lamp is held < 1 cm from the sample. 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF system. | Olympus | Additional information about the imaging system can be found in Figure 6 | |
| Mosaic digital diaphragm | Andor | ||
| Slidebook software | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the structure and function of the immunological synapse. Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).
- Liu, X., Huse, M. Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction. Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Dustin, M. Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers. Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).
- Chauveau, A., Le Floc’h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a., Huse, M. Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse. Sci. Signal. 7, ra82 (2014).
- Huse, M., et al. Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist. Immunity. 27, 76-88 (2007).
- Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells. Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).
- Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse. PLoS One. 9, 1-8 (2014).
- Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).
- Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells. Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).
- Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).
- Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).
- Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).
- Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).
- Nguyen Duc, T., Huse, M. A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors. ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).
- Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. Temporally precise in vivo control of intracellular signalling. Nature. 458, 1025-1029 (2009).
- Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
- Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).
- Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
- Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors. Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).
- Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).
- Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).
