التحقيق "تضر الآثار من منخفضة الضغط البلازما التعقيم" على البقاء لجراثيم Bacillus نجحت "باستخدام خلية يعيش مجهرية"
Summary
هذا البروتوكول يوضح الخطوات المتتالية الهامة اللازمة لتقييم مدى أهمية رصد المعلمة الحيوية وعمليات إصلاح الحمض النووي في أحياء أبواغ عصيات نجحت بعد العلاج مع انخفاض ضغط البلازما بواسطة تتبع إصلاح الحمض النووي المسمى fluorescence البروتينات عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل] حل الوقت ومسح المجهر الإلكتروني.
Abstract
التعقيم البلازما بديلاً واعداً لطرق التعقيم التقليدية لأغراض رحلات الفضاء والصناعية والطبية،. تصريف الضغط المنخفض البلازما (الطب الخاص المحدود) تحتوي على مجموعة واسعة من الأنواع النشطة، والتي تؤدي إلى المنظمة الميكروبية السريع. دراسة كفاءة والآليات للتعقيم بالطب الخاص المحدود، نستخدم جراثيم الكائن اختبار نجحت عصية بسبب مقاومتهم إجراءات التعقيم التقليدية غير عادية. يصف لنا إنتاج نجحت بوغ مونولاييرس، عملية التعقيم بالضغط المنخفض البلازما في مفاعل بلازما الحث يقترن مزدوجة لتوصيف مورفولوجيا بوغ باستخدام المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)، تحليل للإنبات ويعتبر امتداداً للجراثيم بخلية حية مجهرية. هدفا رئيسيا للأنواع البلازما المواد الجينية (DNA) وإصلاح الحمض النووي البلازما المستحثة الآفات على أحياء بوغ أمر حاسم لبقاء الكائن الحي. هنا، علينا أن ندرس قدرة إنبات جراثيم وإصلاح دور الحمض النووي أثناء الإنبات بوغ وثمرة بعد العلاج بالطب الخاص المحدود بتتبع المسمى فلوريسسينتلي الحمض النووي إصلاح البروتينات (RecA) مع حل وقت الأسفار [كنفوكل] مجهرية. تعامل وتفعيلها لإنبات مونولاييرس بوغ غير المعالجة وتصور مع مجهر مقلوب خلية يعيش [كنفوكل] مرور الوقت لمتابعة رد فعل جراثيم فردية. لدينا الملاحظات تكشف عن أن الكسر الإنبات وتعدى جراثيم يعتمد على مدة الطب الخاص المحدود-العلاج تصل إلى الحد أدنى بعد 120 س. RecA-يفب الأسفار (الأسفار الصفراء البروتين) تم اكتشاف إلا في عدد قليل من الجراثيم وتطويرها في جميع تعدى الخلايا مع ارتفاع طفيف في المعالجة بالطب الخاص المحدود جراثيم. وعلاوة على ذلك، بعض من البكتيريا النباتية المستمدة من جراثيم المعالجة بالطب الخاص المحدود وأظهرت زيادة في السيتوبلازم، وتميل إلى ليس. يمكن أن تكون الأساليب المذكورة لتحليل جراثيم فردية مثالية لدراسة الجوانب الأخرى لإنبات بوغ وثمرة.
Introduction
هدفا رئيسيا لاستكشاف الفضاء هو البحث عن التوقيعات من أشكال الحياة والجزيئات الحيوية الأخرى الهيئات الكواكب والأقمار في نظامنا الشمسي. نقل الكائنات الدقيقة أو الجزيئات الحيوية المنشأ الأرضي للمناطق الحرجة للاستكشاف لمخاطر خاصة لتأثير التنمية وسلامة البعثات الحياة-الكشف عن هيئات الكواكب مثل المريخ وأوروبا1. فرض أنظمة صارمة على بعثات مأهولة والروبوتية إلى الكواكب الأخرى وهذه الأقمار والكويكبات والسماوية الأخرى المبادئ التوجيهية الدولية لحماية الكوكب، أنشئ بلجنة أبحاث الفضاء (كوسبار) في عام 1967، وتنظم تنظيف وتعقيم لمركبة فضائية ومكونات الأجهزة الحاسمة السابقة لإطلاق بغية القضاء على تلوث الكائنات الأرضية الدقيقة ومنع حدوث التلوث المنتقل من الإجرام السماوية2. على مدى العقد الماضي، اكتسبت تطبيق البلازما غير الحرارية اهتماما واسعاً في مجال البحوث الطبية والغذائية، وكذلك في رحلات الفضاء تطبيقات3،،من45. التعقيم البلازما بديلاً واعداً لطرق التعقيم التقليدية كما أنها توفر سرعة وكفاءة المنظمة الميكروبية6، بينما يجري لطيف الحساسة والمواد مجا الحرارة. تصريفات بلازما تحتوي على خليط عوامل المتفاعلة مثل الجذور الحرة، والجسيمات المشحونة، الذرات المحايدة/متحمس، الفوتونات في الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية)، وطيف الأشعة فوق البنفسجية فراغ (VUV) التي تؤدي إلى المنظمة الميكروبية السريع3. في هذه الدراسة، ونحن نستخدم الضغط المنخفض البلازما المتولدة عن مصدر بلازما الحث يقترن الضغط المنخفض (ديكب) مزدوجة7،8 لإلغاء تنشيط نجحت Bacillus اندوسبوريس توزع على سطح الزجاج الاختبار.
بكتيريا إيجابية للأسرة باسيلاسيي وتوزع على نطاق واسع في الموائل الطبيعية للتربة، والرواسب، والهواء، وكذلك كما هو الحال في بيئات غير عادية مثل مرافق غرفة نظيفة و “محطة الفضاء الدولية”9،10 ،11. الميزة الأكثر من متميزة من جنس Bacillus هو القدرة على تشكيل مقاومة عالية اندوسبوريس نائمة (يشار إليه فيما يلي الجراثيم) البقاء على قيد الحياة في ظروف غير مواتية، مثل استنفاد المغذيات12. جراثيم تقاوم عموما أكثر بكثير من نظرائهم من الخلية النباتية لمجموعة متنوعة من العلاجات، والضغوط البيئية، بما في ذلك الحرارة والأشعة فوق البنفسجية واشعاع غاما، وجفاف، اضطراب الميكانيكية والمواد الكيميائية السامة، مثل المؤكسدات القوية أو وكلاء تغيير الأس الهيدروجيني (إعادة النظر في الإشارات13،14) وبالتالي فكائنات مثالية لاختبار كفاءة أساليب المنظمة الميكروبية. نظراً للحمض النووي هدفا رئيسيا لعلاج البكتيريا15،16، إصلاح آفات الحمض النووي الناجم عن البلازما البلازما (مثل فواصل حبلا الحمض النووي المزدوج) عند بوغ أحياء أمر حاسم لبقاء البكتيريا13، 17.
وبالتالي، علينا دراسة قدرة إنبات الجراثيم ودور إصلاح الحمض النووي أثناء الإنبات بوغ وثمرة بعد علاج الجراثيم مع بلازما الأرغون الضغط المنخفض بجراثيم الفردية التالية وإصلاح التعبير عنها من الحمض النووي المسمى الأسفار بروتين RecA مع حل وقت الأسفار [كنفوكل] مجهرية. أننا نعطي تعليمات خطوة بخطوة لإعداد الجراثيم ب-نجحت في مونولاييرس لتحقيق نتائج الاختبار استنساخه، معاملة مونولاييرس سبور مع البلازما الضغط المنخفض للتعقيم، وإعداد جراثيم البلازما تعامل التقييم ultrastructural باستخدام المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)، والتحليل المجهري خلية حية على مستوى جراثيم فردية في الحفل مع رصد الحمض النووي النشطة إصلاح العمليات التي تحدث داخل الخلية في الاستجابة للمعالجة بالبلازما.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعقيم أسطح باستخدام درجات الحرارة المنخفضة والضغط المنخفض البلازما بديلاً واعداً لإجراءات التعقيم بدلاً من التقليدية مثل العلاج بالمواد الكيميائية، الإشعاع المؤين (مثل الغازات مثل ح2س2 أو أكسيد الإيثيلين) أو الحرارة الجافة والرطبة23. توفير أساليب التعقيم ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون شرودر أندريا لها المساعدة التقنية الممتازة خلال أجزاء من هذا العمل واولريش جيه نيكا لمساعدتها خلال تبادل لإطلاق النار الفيديو. كما نود أن نشكر سيمونز ألف إيل لأن التبرع السخي من سلالات Bacillus نجحت : LAS72 و LAS24. كان دعم هذا العمل في أجزاء من المنح من مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) باكيتانتراج (بلاسماديكون باك 728) للسلطة الفلسطينية (فصيل عبد الواحد 7/3-1)، وجمهورية مقدونيا (2023 مو/2-1) ودلر منح الحياة المحطة الفضائية الدولية DLR-فو-صورة الصحافة، البرنامج RF-فو، تيلبروجرام 475 (إلى F.M.F، ومحمد، وجمهورية مقدونيا). F.M.F. أيده على منحة دكتوراه من “مدرسة بحوث علوم الحياة الفضائية هلمهولتز” (سباسيليفي) في الألماني (DLR) في كولونيا، ألمانيا، التي مولتها “الرابطة هلمهولتز” (هلمهولتز-نزاع) على مدى فترة السنوات الست ( رقم المنحة VH-KO-300) وحصلت على أموال إضافية من شؤون الفضاء الجوي، بما في ذلك المجلس التنفيذي الفضاء الجوي، ومعهد طب الفضاء الجوي. وستدرج نتائج هذه الدراسة في أطروحة دكتوراه فيليكس م. فوكس.
Materials
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
References
- Nicholson, W. L., Schuerger, A. C., Race, M. S. Migrating microbes and planetary protection. Trends Microbiol. 17, 389-392 (2009).
- COSPAR. COSPAR Planetery Protection Policy. Space Research Today, COSPAR’s Information Bulletin. 193, 1-14 (2015).
- De Geyter, N., Morent, R. Nonthermal plasma sterilization of living and nonliving surfaces. Annu Rev Biomed Eng. 14, 255-274 (2012).
- Shimizu, S., et al. Cold atmospheric plasma – A new technology for spacecraft component decontamination. Planet. Space Sci. 90, 60-71 (2014).
- Lerouge, S., Fozza, A. C., Wertheimer, M. R., Marchand, R., Yahia, L. H. Sterilization by Low-Pressure Plasma: The Role of Vacuum-Ultraviolet Radiation. Plasma Polym. 5, 31-46 (2000).
- Rossi, F., Kylián, O., Rauscher, H., Gilliland, D., Sirghi, L. Use of a low-pressure plasma discharge for the decontamination and sterilization of medical devices. Pure Appl. Chem. 80, 1939-1951 (2008).
- Halfmann, H., Hauser, J., Awakowicz, P., Koller, M., Esenwein, S. A. A double inductively coupled low-pressure plasma for sterilization of medical implant materials. Biomed Tech (Berl). 53, 199-203 (2008).
- Halfmann, H., Denis, B., Bibinov, N., Wunderlich, J., Awakowicz, P. Identification of the most efficient VUV/UV radiation for plasma based inactivation of Bacillus atrophaeus spores. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 5907 (2007).
- Vaishampayan, P., et al. Bacillus horneckiae sp. nov., isolated from a spacecraft-assembly clean room. Int J Syst Evol Microbiol. 60, 1031-1037 (2010).
- Mandic-Mulec, I., Stefanic, P., van Elsas, J. D. Ecology of Bacillaceae. Microbiol Spectr. 3, (2015).
- Alekhova, T. A., et al. Diversity of bacteria of the genus Bacillus on board of international space station. Dokl Biochem Biophys. 465, 347-350 (2015).
- Claus, D., Bekerley, R. C. W., Sneath, P. A. Genus Bacillus Cohn 1872. Bergey’s manual of systematic bacteriology. 2, 1105-1141 (1986).
- Setlow, P. Spore Resistance Properties. Microbiol Spectr. 2, (2014).
- Setlow, P. Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat and chemicals. J Appl Microbiol. 101, 514-525 (2006).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Characterization of Bacillus subtilis spore inactivation in low-pressure, low-temperature gas plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 108, 521-531 (2010).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Response of Deinococcus radiodurans to low-pressure low-temperature plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 109, 1521-1530 (2010).
- Setlow, B., Setlow, P. Role of DNA repair in Bacillus subtilis spore resistance. J Bacteriol. 178, 3486-3495 (1996).
- Schaeffer, P., Millet, J., Aubert, J. P. Catabolic repression of bacterial sporulation. Proc. Natl. Acad. Sci. 54, 704-711 (1965).
- Simmons, L. A., et al. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Raguse, M., et al. Improvement of Biological Indicators by Uniformly Distributing Bacillus subtilis Spores in Monolayers To Evaluate Enhanced Spore Decontamination Technologies. Appl Environ Microbiol. 82, 2031-2038 (2016).
- Horneck, G., et al. Protection of bacterial spores in space, a contribution to the discussion on Panspermia. Orig Life Evol Biosph. 31, 527-547 (2001).
- Opretzka, J., Benedikt, J., Awakowicz, P., Wunderlich, J., Keudell, A. v. The role of chemical sputtering during plasma sterilization of Bacillus atrophaeus. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 2826 (2007).
- Stapelmann, K., et al. Utilization of low-pressure plasma to inactivate bacterial spores on stainless steel screws. Int. J. Astrobiol. 13, 597-606 (2013).
- Raguse, M., et al. Understanding of the importance of the spore coat structure and pigmentation in the Bacillus subtilis spore resistance to low-pressure plasma sterilization. J. Phys. D: Appl. Phys. 49, 285401 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS one. 8, e58972 (2013).
