Investigando os prejudiciais efeitos de baixa pressão Plasma esterilização na sobrevivência de esporos de Bacillus subtilis usando Live celular microscopia
Summary
Este protocolo ilustra as etapas consecutivas importantes, necessárias para avaliar a pertinência de monitoramento parâmetro de vitalidade e os processos de reparação do DNA em reviving esporos de Bacillus subtilis após o tratamento com plasma de baixa pressão de tracking proteínas através do tempo-resolvido microscopia confocal e microscopia eletrônica de reparo de DNA marcado com fluorescência.
Abstract
Esterilização plasma é uma alternativa promissora para os métodos de esterilização convencionais para fins de exploração espacial e industrial, clínica. Descargas de baixa pressão plasma (LPP) contenham um amplo espectro de espécies ativas, que levam a inativação microbiana rápida. Para estudar a eficiência e a mecanismos de esterilização por LPP, usamos os esporos do Bacillus subtilis organismo teste por causa de sua extraordinária resistência contra procedimentos de esterilização convencionais. Descrevemos a produção de monocamadas de esporos de b. subtilis , o processo de esterilização por plasma de baixa pressão em um reator de plasma indutivo duplo, a caracterização da morfologia dos esporos usando microscopia eletrônica de varredura (MEV) e o análise da germinação e consequência de esporos por microscopia de células vivas. Um alvo principal das espécies de plasma é material genómico (DNA) e reparo de lesões de DNA induzida por plasma sobre avivamento esporo é crucial para a sobrevivência do organismo. Aqui, podemos estudar a capacidade de germinação dos esporos e o papel do DNA reparo durante a germinação dos esporos e consequência natural após o tratamento com LPP rastreando fluorescente etiquetado DNA reparo proteínas (RecA) com microscopia de fluorescência confocal tempo-resolvido. Tratados e monocamadas de esporos não tratados são ativadas para a germinação e visualizadas com um microscópio invertido confocal célula viva ao longo do tempo a seguir a reação dos esporos individuais. Nossas observações revelam que a fração de germinação e superando os esporos é dependente da duração do LPP-tratamento, atingindo um mínimo após 120 s. RecA-YFP fluorescência (proteína de fluorescência amarela) foi detectada apenas em alguns esporos e desenvolvida em toda a superando as células com uma ligeira elevação no LPP-tratados esporos. Além disso, algumas das bactérias vegetativas derivado LPP-tratados esporos mostrou um aumento no citoplasma e tendiam a lyse. Os métodos descritos para análise de esporos individuais podem ser exemplares para o estudo de outros aspectos da germinação de esporos e consequência.
Introduction
Dos principais objetivos da exploração espacial é a busca de assinaturas de formas de vida e biomoléculas em outros planetas e luas em nosso sistema solar. A transferência de microorganismos ou biomoléculas de origem terrestre, de áreas críticas de exploração é de risco especial para o impacto do desenvolvimento e integridade das missões de deteção de vida em planetas como Marte e Europa1. As diretrizes internacionais de proteção planetária, estabelecida pelo Comité de pesquisa espacial (sistema) em 1967, impor normas rigorosas em missões tripuladas e robóticas para outros planetas, suas luas, asteroides e outros corpos celestes e regular o limpeza e esterilização de uma nave espacial e componentes de hardware crítico prévios para lançar a fim de eliminar a contaminação de microorganismos terrestres e evitar contaminação cruzada de corpos celestes2. Na última década, a aplicação de plasmas não térmicos ganhou ampla atenção na pesquisa biomédica e nutricional, bem como em aplicações de voo espacial3,4,5. Esterilização plasma é uma alternativa promissora aos métodos convencionais de esterilização que oferece rápida e eficiente de inactivação microbiana6, sendo suave para sensíveis e materiais lábeis de calor. Descargas de plasma contêm uma mistura de agentes reativos como os radicais livres, partículas carregadas, neutro/excitado átomos fótons no ultravioleta (UV) e espectro ultravioleta de vácuo (VUV) que levam a inativação microbiana rápida3. Neste estudo, utilizamos o plasma de baixa pressão gerada pelo duplo plasma indutivo de baixa pressão (DICP) fonte7,8 para inactivar endósporos de Bacillus subtilis distribuídos na superfície de ensaio de vidro.
Bactérias gram-positivas da família bacilos são amplamente distribuídas em habitats naturais do solo, sedimentos e ar, bem como em ambientes incomuns, tais como instalações de sala limpa e a estação espacial internacional9,10 ,11. A característica mais distinta do gênero Bacillus é a capacidade de formar altamente resistentes endósporos dormentes (doravante referidos como esporos) para sobreviver a condições desfavoráveis, tais como esgotamento de nutrientes12. Os esporos são geralmente muito mais resistentes do que suas contrapartes de célula vegetativa de uma variedade de tratamentos e estresses ambientais, incluindo o calor, UV, radiação gama, dessecação, ruptura mecânica e produtos químicos tóxicos, tais como oxidantes fortes ou agentes de mudança de pH (revistos em referências13,14) e, portanto, são objetos ideais para testar a eficiência dos métodos de inativação microbiana. Desde que o DNA genômico é um alvo principal do tratamento de bactérias15,16, o reparo de lesões de DNA induzida por plasma plasma (por exemplo, quebras de dupla cadeia de DNA) em cima do esporo revival é crucial para a sobrevivência de bactérias13, 17.
Assim, estudamos a capacidade de germinação dos esporos e o papel do reparo de DNA durante a germinação dos esporos e consequência natural após ter tratado os esporos com plasma de argônio de baixa pressão por seguintes esporos individuais e reparar sua expressão de DNA marcado com fluorescência proteína RecA com microscopia de fluorescência confocal tempo-resolvido. Nós damos uma instrução passo a passo da preparação de esporos de b. subtilis em monocamadas para alcançar resultados reprodutíveis, o tratamento de monocamadas de esporo com plasma de baixa pressão para esterilização, a preparação de esporos de plasma Tratado para avaliação ultraestrutural usando microscopia eletrônica de varredura (MEV) e análise de microscopia célula viva ao nível dos esporos individuais em concerto com o monitoramento do DNA ativo reparar processos que ocorrem dentro da célula em resposta a um tratamento de plasma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esterilização de superfícies utilizando baixa temperatura, baixa pressão plasma é uma alternativa promissora para procedimentos de esterilização bastante convencional, tais como o tratamento com radiação ionizante a radiação, produtos químicos (por exemplo, gases como H2O2 ou óxido de etileno) ou calor seco e úmido,23. Métodos de esterilização comum principalmente fornecem uma esterilização eficaz, mas eles são conhecidos por influenciar o materia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores Andrea Schröder agradecer a excelente assistência técnica durante as partes deste trabalho e Nikea J. Ulrich pela sua assistência durante a gravação do vídeo. Gostaríamos também de agradecer a Lyle A. Simmons por sua generosa doação das estirpes de Bacillus subtilis : LAS72 e LAS24. Este trabalho foi financiado em partes por subsídios desde a Fundação de pesquisa alemã (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon PAK 728) para PA (AW 7/3-1) e RM (MO 2023/2-1) e o DLR concedem vida de ISS DLR-FuW-Projekt, Programm RF-FuW, Teilprogramm 475 (F.M.F, M.R. e R.M.). F.M.F. foi apoiado por uma bolsa de doutoramento da escola de Helmholtz espaço Life Sciences Research (SpaceLife) no centro aeroespacial alemão (DLR), em Colónia, na Alemanha, que foi financiado pela Associação Helmholtz (Helmholtz-Gemeinschaft) durante um período de seis anos ( N º de Grant VH-ko-300) e recebeu fundos adicionais do DLR, incluindo o Conselho Executivo aeroespacial e o Instituto de Medicina Aeroespacial. Os resultados deste estudo serão incluídos na tese de doutorado de Felix M. Fuchs.
Materials
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
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