Расследование пагубные последствия низкого давления плазмы стерилизации на выживание Bacillus subtilis споры с помощью Live клеток микроскопии
Summary
Этот протокол иллюстрирует важный подряд шаги, необходимые для оценки релевантности мониторинга жизнеспособность параметров и процессов репарации ДНК в оживлении спор Bacillus subtilis после лечения с плазмой низкого давления путем отслеживания помечены флуоресцентным ДНК ремонт белков через время решена confocal микроскопии и растровая электронная микроскопия.
Abstract
Плазменная стерилизация является перспективной альтернативой обычной стерилизации методов для целей космических полетов и промышленной, клинической. Низкого давления плазмы (LPP) выбросы содержат широкий спектр активных видов, которые приводят к быстрой микробной инактивации. Для изучения эффективности и механизмы стерилизации в ЗПС, мы используем споры тест организма Сенная палочка из-за их чрезвычайные сопротивления против обычных стерилизацию. Мы описываем производства B. subtilis споро монослои, процесс стерилизации, плазмы низкого давления в двойной реактор индуктивно связанной плазмы, характеристика споро морфологии, используя растровая электронная микроскопия (SEM) и анализ всхожесть и нарост споры по микроскопии живой клетки. Одной из основных целей видов плазмы – геномный материал (ДНК) и ремонт плазмы индуцированные поражения ДНК после возрождения споро имеет решающее значение для выживания организма. Здесь мы изучаем возможности прорастание спор и роль ДНК ремонта во время прорастания спор и нарост после лечения с ЗПС отслеживая дневно помечены ДНК ремонт белки (RecA) с раз решить конфокальный флуоресцентной микроскопии. Лечение и неочищенных споро монослои активирована для проращивания и визуализируется с помощью микроскопа Перевернутый конфокальный живой клетки с течением времени следить за реакцией отдельных споры. Наши наблюдения показывают, что часть прорастать и перерастает споры зависит продолжительность ЗПС лечения, достигая минимума после 120 s. RecA-рекламы ЯФП флуоресценции (желтый флуоресценции белков) был обнаружен только в немногих споры и развитым во всех перерастает клетки с небольшой высоты в ЗПС рассматривать споры. Кроме того некоторые из вегетативных бактерий производным от ЗПС рассматривать споры, показало увеличение в цитоплазме и склонны лизируют. Описаны методы для анализа индивидуальных спор может быть образцовым для изучения других аспектов прорастание спор и развитие.
Introduction
Основная цель исследования космического пространства является поиск для подписи форм жизни и биомолекул на других планетных тел и Луны в нашей солнечной системе. Передачи микроорганизмов или биомолекулами наземного происхождения в критических областях разведки — особого риска для воздействия развития и целостность жизни обнаружение миссий на планетных тел, например, Марс и Европа1. Международные руководящие принципы по планетарной защиты, созданная в Комитет по космическим исследованиям (КОСПАР) в 1967 году, налагать строгие правила о пилотируемых и робототехнические миссий в других планет, их спутников, астероидов и других небесных телах и регулировать Очистка и стерилизация космических аппаратов и критических аппаратных компонентов предварительного запуска для ликвидации загрязнения земной микроорганизмов и предотвращения перекрестного загрязнения небесных тел2. За последнее десятилетие применения плазм-тепловой получила широкое внимание в исследовании биомедицинских и питания, а также в космонавтике приложений3,4,5. Плазменная стерилизация является перспективной альтернативой обычной стерилизации методы, как она предлагает быстрое и эффективное микробной инактивации6, будучи нежный для чувствительной и лабильных материалы. Плазмы сбросов содержат смесь реактивных агентов, таких как свободные радикалы, заряженные частицы, нейтральный/возбужденных атомов, Фотоны ультрафиолетового (УФ) и вакуумного ультрафиолетового (VUV) спектра, которые приводят к быстрой микробной инактивации3. В этом исследовании мы используем низкого давления плазмы, порожденные двойной индуктивно связанной плазмы низкого давления (DICP) источник7,–8 для инактивации спор Bacillus subtilis , распределенных на испытательной поверхности стекла.
Грам-положительных бактерий семейства Bacillaceae широко распространены в естественной среде обитания, почвы, отложений, и воздух, как хорошо необычных средах, таких как чистых помещений и международной космической станции9,10 ,11. Наиболее отличительной чертой рода Bacillus является способность образовывать высокой устойчивостью спящие спор (именуемый далее “споры”) чтобы выжить неблагоприятные условия, такие как истощение питательных веществ12. Споры обычно гораздо более устойчивы, чем их коллеги вегетативная клетка для различных процедур и экологическим стрессам, в том числе тепла, УФ, гамма-облучения, сушка, механические нарушения и токсичных химических веществ, таких как сильные окислители или изменение рН агентов (обзор в ссылки на13,14) и поэтому идеальные объекты для тестирования эффективности методов инактивации микроорганизмов. Так как геномной ДНК является одной из основных целей плазменной обработки бактерий15,16, ремонт плазмы индуцированных повреждений ДНК (например ломает двойной нити ДНК) после споро возрождения имеет решающее значение для выживания бактерий13, 17.
Таким образом мы изучаем всхожести споры и роль ДНК ремонта во время прорастания спор и нарост после лечения споры с аргоном плазмы низкого давления, следующие отдельные споры и их выражение помечены флуоресцентным ДНК ремонт белок RecA с раз решить конфокальный флуоресцентной микроскопии. Мы предоставляем шаг за шагом инструкции подготовки B. subtilis споры в монослои для достижения воспроизводимые результаты, лечение монослои спор с плазмой низкого давления для стерилизации, подготовка плазмы рассматривать споры для Ультраструктурные оценки с использованием растровая электронная микроскопия (SEM) и анализа микроскопии живых клеток на уровне отдельных споры в концерте с мониторинг активных ДНК ремонт процессов, происходящих внутри клетки в ответ на плазменной обработки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Стерилизации поверхностей с использованием низкотемпературной плазмы низкого давления является перспективной альтернативой довольно обычной стерилизации процедуры, такие как лечение с ионизирующим излучением, химических веществ (например газов как H2O2 или окись эт?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Андреа Schröder за ее прекрасную техническую помощь во время части этой работы и Nikea J. Ulrich за ее помощь во время съемок. Мы также хотели бы поблагодарить за его щедрое пожертвование штаммы Bacillus subtilis Lyle а. Симмонс: LAS72 и LAS24. Эта работа была поддержана в части субсидий от немецкого фонда научных исследований (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon Пак 728) Па (AW 7/3-1) и RM (MO 2023/2-1) и DLR предоставить DLR-FuW-Projekt МКС жизни, программа RF-FuW, Teilprogramm 475 (F.M.F, м.р. и р.м.). F.M.F. была поддержана стипендии PhD Гельмгольца космических наук о жизни научной школы (SpaceLife) на Германский аэрокосмический центр (ДЛР) в Кёльне, Германия, которая финансировалась Гельмгольца (Гельмгольц-объединением) в течение шести лет) Грант № VH-Ko-300) и получил дополнительные средства от DLR, включая Исполнительный совет аэрокосмической и института аэрокосмической медицины. Результаты этого исследования будут включены в кандидатской диссертации Феликс м. Фукс.
Materials
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
References
- Nicholson, W. L., Schuerger, A. C., Race, M. S. Migrating microbes and planetary protection. Trends Microbiol. 17, 389-392 (2009).
- COSPAR. COSPAR Planetery Protection Policy. Space Research Today, COSPAR’s Information Bulletin. 193, 1-14 (2015).
- De Geyter, N., Morent, R. Nonthermal plasma sterilization of living and nonliving surfaces. Annu Rev Biomed Eng. 14, 255-274 (2012).
- Shimizu, S., et al. Cold atmospheric plasma – A new technology for spacecraft component decontamination. Planet. Space Sci. 90, 60-71 (2014).
- Lerouge, S., Fozza, A. C., Wertheimer, M. R., Marchand, R., Yahia, L. H. Sterilization by Low-Pressure Plasma: The Role of Vacuum-Ultraviolet Radiation. Plasma Polym. 5, 31-46 (2000).
- Rossi, F., Kylián, O., Rauscher, H., Gilliland, D., Sirghi, L. Use of a low-pressure plasma discharge for the decontamination and sterilization of medical devices. Pure Appl. Chem. 80, 1939-1951 (2008).
- Halfmann, H., Hauser, J., Awakowicz, P., Koller, M., Esenwein, S. A. A double inductively coupled low-pressure plasma for sterilization of medical implant materials. Biomed Tech (Berl). 53, 199-203 (2008).
- Halfmann, H., Denis, B., Bibinov, N., Wunderlich, J., Awakowicz, P. Identification of the most efficient VUV/UV radiation for plasma based inactivation of Bacillus atrophaeus spores. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 5907 (2007).
- Vaishampayan, P., et al. Bacillus horneckiae sp. nov., isolated from a spacecraft-assembly clean room. Int J Syst Evol Microbiol. 60, 1031-1037 (2010).
- Mandic-Mulec, I., Stefanic, P., van Elsas, J. D. Ecology of Bacillaceae. Microbiol Spectr. 3, (2015).
- Alekhova, T. A., et al. Diversity of bacteria of the genus Bacillus on board of international space station. Dokl Biochem Biophys. 465, 347-350 (2015).
- Claus, D., Bekerley, R. C. W., Sneath, P. A. Genus Bacillus Cohn 1872. Bergey’s manual of systematic bacteriology. 2, 1105-1141 (1986).
- Setlow, P. Spore Resistance Properties. Microbiol Spectr. 2, (2014).
- Setlow, P. Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat and chemicals. J Appl Microbiol. 101, 514-525 (2006).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Characterization of Bacillus subtilis spore inactivation in low-pressure, low-temperature gas plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 108, 521-531 (2010).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Response of Deinococcus radiodurans to low-pressure low-temperature plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 109, 1521-1530 (2010).
- Setlow, B., Setlow, P. Role of DNA repair in Bacillus subtilis spore resistance. J Bacteriol. 178, 3486-3495 (1996).
- Schaeffer, P., Millet, J., Aubert, J. P. Catabolic repression of bacterial sporulation. Proc. Natl. Acad. Sci. 54, 704-711 (1965).
- Simmons, L. A., et al. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Raguse, M., et al. Improvement of Biological Indicators by Uniformly Distributing Bacillus subtilis Spores in Monolayers To Evaluate Enhanced Spore Decontamination Technologies. Appl Environ Microbiol. 82, 2031-2038 (2016).
- Horneck, G., et al. Protection of bacterial spores in space, a contribution to the discussion on Panspermia. Orig Life Evol Biosph. 31, 527-547 (2001).
- Opretzka, J., Benedikt, J., Awakowicz, P., Wunderlich, J., Keudell, A. v. The role of chemical sputtering during plasma sterilization of Bacillus atrophaeus. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 2826 (2007).
- Stapelmann, K., et al. Utilization of low-pressure plasma to inactivate bacterial spores on stainless steel screws. Int. J. Astrobiol. 13, 597-606 (2013).
- Raguse, M., et al. Understanding of the importance of the spore coat structure and pigmentation in the Bacillus subtilis spore resistance to low-pressure plasma sterilization. J. Phys. D: Appl. Phys. 49, 285401 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS one. 8, e58972 (2013).
