有害な効果の低圧プラズマ滅菌を使用して住んでいる携帯顕微鏡枯草菌胞子の生存に調査
Summary
このプロトコルは追跡による活力パラメーターと枯草菌胞子を低圧プラズマ治療後復活で DNA 修復プロセスの監視の関連性を評価するために必要な重要な連続した手順を示しています蛍光標識された DNA は、時間分解共焦点顕微鏡と走査電子顕微鏡でタンパク質を修復します。
Abstract
プラズマ滅菌は、工業、医療、および宇宙飛行の目的の従来の殺菌法に有望な代替手段です。低圧プラズマ (LPP) 放電には、急速な微生物の不活化につながる活性種の広範なスペクトルが含まれています。効率と LPP による殺菌のメカニズムを研究、従来の滅菌手順に対する異常な抵抗のため試験生物枯草菌の胞子を使用します。B. 枯草菌胞子膜、二重誘導結合プラズマ反応器、走査型電子顕微鏡 (SEM) を用いて胞子形態の評価低圧プラズマによる滅菌処理の生産について述べると、発芽と生細胞顕微鏡検査によって胞子の副産物の分析。プラズマ種の主要なターゲットはゲノム物質 (DNA)、胞子復活時にプラズマ照射誘起 DNA 傷害の修復は生物の生存のため重要です。ここでは、胞子の発芽能力を研究および DNA の役割が追跡する蛍光標識 DNA 修復タンパク質 (RecA) 時間分解共焦点蛍光顕微鏡を用いた LPP 治療後胞子の発芽および伸長中に修復します。扱われ、未処理胞子膜の発芽の活性化し個々 の胞子の反応に従うことに時間をかけて倒立共焦点ライブセル顕微鏡で可視化します。我々 の観察が種子の発芽と手狭になったため胞子の割合 LPP 治療後 120 秒 RecA YFP (黄色蛍光タンパク質) 蛍光がいくつかの胞子でのみ検出され、すべてで開発された最小値に達する期間の依存を明らかにLPP 扱われる胞子のわずかな上昇と細胞は手狭になった。また、栄養の細菌のいくつかは LPP 扱われる胞子細胞質の増加を示したから派生し、溶解する傾向があった。個々 の胞子の分析記述されている方法は、胞子の発芽および伸長の他の側面に関する模範的な可能性があります。
Introduction
宇宙開発の主要な目標は、生命と他の惑星や太陽系の衛星生体分子の署名の検索です。微生物の伝達や生体関連物質探査の重要な領域への地球の起源の開発と惑星火星、エウロパの1などの生命検出ミッションの整合性に影響を与える特定のリスクです。他の惑星、その衛星、小惑星、および他の天体への有人とロボット ミッションに厳格な規制を課すの空間研究委員会 (日本) によってを 1967 年に設立、惑星保護の国際ガイドラインと規制、クリーニングおよび地球の微生物の汚染を排除し、天体2の交差汚染を防止するために起動する宇宙船と重要なハードウェア コンポーネントの事前の滅菌。最後の 10 年間、非熱平衡プラズマ中のアプリケーションは、医学・栄養の研究だけでなく宇宙飛行アプリケーション3,4、5ワイドの注目を集めています。プラズマ滅菌は、機密にやさしい、熱に不安定な物質でありながら迅速かつ効率的な微生物不活化6を提供しています従来の滅菌法に有望な代替手段です。プラズマ放電には、フリーラジカル、荷電粒子、中立/励起原子、急速な微生物不活化3につながる uv (紫外線) と真空紫外 (VUV) スペクトルの光子などの反応剤の混合物が含まれています。本研究では枯草endospores ガラス試料の表面上に分散を不活化するのに二重低圧誘導結合プラズマ (DICP) ソース7,8によって生成された低圧プラズマを使用します。
家族同定のグラム陽性菌は土壌、堆積物、空気とクリーン ルーム設備、国際宇宙ステーションの9,10 など異常な環境の自然の生息地に広く分布します。 ,11。属細菌の最も明確な特徴は、栄養枯渇12などの不利な条件を生き残るために強い休眠 endospores (以下、胞子) を形成する能力です。胞子は、様々 なトリートメント、熱、紫外線、γ 線照射、乾燥、機械的な混乱、強力な酸化剤などの有害化学物質などの環境ストレスに植物細胞により一般的にはるかに耐性や(参照13,14の見直し) pH 変更エージェント微生物不活化手法の有効性をテストするための理想的なオブジェクトであるためです。ゲノム DNA は細菌15,16, プラズマ照射誘起 DNA 傷害の修復のプラズマ治療の主要な目標 (例えば DNA 二重鎖切断) 胞子に復活は細菌13の生存のために重要な 17。
したがって、我々 は次の個々 の胞子によって低圧アルゴン プラズマを用いた胞子の治療後胞子の発芽および伸長中に胞子の発芽能力と DNA 修復の役割を研究し、蛍光標識された DNA の発現を修復時間分解共焦点蛍光顕微鏡を用いたタンパク質 RecA。我々 は、再現性のあるテスト結果、殺菌用低圧プラズマを用いた胞子膜の処理、プラズマ処理胞子のための準備を達成するため単分子膜におけるB. 枯草菌芽胞の準備のステップバイ ステップの説明を与えるアクティブな DNA の監視と連携して個々 の胞子のレベルで走査型電子顕微鏡 (SEM) と生細胞顕微鏡による解析を用いた微細構造の評価は、プラズマ治療への反応で細胞内で発生するプロセスを修復します。
Protocol
Representative Results
Discussion
低温を使用して表面の殺菌、低圧プラズマは、電離放射線、化学物質による治療などではなく従来の滅菌手順に有望な代替手段 (例えばガスのように H2O2または酸化エチレン) または乾燥及び湿潤熱23。普通の滅菌方法ほとんど効果的な殺菌がオペレーターの潜在的なリスクを示し、治療材料に影響を与える知られています。低圧プラズマは紫外線の光?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者はアンドレア ・ シュレーダーのビデオの撮影中に彼女の援助のためのこの仕事と Nikea ・ j ・ ウルリッヒの部分の間に彼女の優秀な技術的な支援をありがちましょう。枯草菌の彼の寛大な寄付のライル ・ A. シモンズに感謝したいと思います: LAS72 と LAS24。この仕事支えられて部分で補助金ドイツ研究振興協会 (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon 朴 728) から PA (AW 7/3-1) に、RM (MO 2023/2-1) と DLR (F.M.F、原産地、r. m.) に Teilprogramm 475, Programm RF FuW DLR FuW Projekt ISS 生命を付与します。F.M.F. は、ヘルムホルツ協会 (ヘルムホルツ Gemeinschaft) (6 年の期間にわたって資金が供給されたケルン、ドイツでドイツ航空宇宙センター (DLR) でヘルムホルツ宇宙生命科学研究学校 (SpaceLife) の博士課程奨学金によって支えられました。グラント号VH-KO-300) 理事航空宇宙航空宇宙医学研究所など、DLR から追加の資金を受け取ったとします。本研究の結果はフェリックス ・ m. フックス博士論文の中に表示されます。
Materials
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
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