Valutazione degli effetti di farmaci a base di anticorpi sul midollo osseo murino e l'attivazione dei macrofagi peritoneali
Summary
Farmaci a base di anticorpi hanno rivoluzionato il trattamento per le malattie infiammatorie. Oltre ad avere effetti diretti su target specifici, gli anticorpi possono attivare i macrofagi per diventare anti-infiammatori. Questo protocollo descrive come antinfiammatorio del macrofago attivazione può essere valutato in vitro utilizzando macrofagi del midollo osseo del topo e in vivo, utilizzando i macrofagi peritoneali.
Abstract
I macrofagi sono fagocitiche cellule dell’immunità innata, che avviare le risposte immunitarie ai patogeni e contribuiscono alla restituzione di tessuto e di guarigione. I macrofagi sono ugualmente importanti nella disattivazione le risposte infiammatorie. Abbiamo dimostrato che i macrofagi stimolati con l’immunoglobulina endovenosa (IVIg) possono produrre le quantità elevate della citochina antinfiammatoria, interleuchina 10 (IL-10) e bassi livelli di citochine pro-infiammatorie in risposta a lipopolisaccaridi batterici ( LPS). IVIg è che un anticorpo polivalente, principalmente immunoglobulina Gs (IgG), riuniti dal plasma di donatori di sangue più di 1.000. Serve a integrare gli anticorpi nei pazienti con deficienze immunitarie o sopprimere le risposte immunitarie in pazienti con condizioni autoimmuni o infiammatorie. Infliximab, un anticorpo di terapeutico anti-tumore necrosi fattore alfa (TNFα), ha anche dimostrato di attivare i macrofagi a produrre IL-10 in risposta a stimoli infiammatori. IVIg e altri biologici basati su anticorpi possono essere testati per determinare i loro effetti sull’attivazione del macrofago. Questo articolo descrive metodi per la derivazione, la stimolazione e la valutazione del midollo osseo murino macrofagi attivati da anticorpi in vitro e macrofagi peritoneali murini attivati con anticorpi in vivo. Infine, dimostriamo l’utilizzo di western blotting per determinare il contributo di specifici percorsi di attività antinfiammatoria del macrofago di segnalazione delle cellule. Questi protocolli possono essere utilizzati con topi geneticamente modificati, per determinare l’effetto di una specifica proteina su attivazione macrofagica anti-infiammatori. Queste tecniche è utilizzabile anche per valutare se biologics specifico può agire modificando i macrofagi a uno stato di attivazione anti-infiammatori producono IL-10 che riduce le risposte infiammatorie in vivo. Questo può fornire informazioni sul ruolo dell’attivazione macrofagica nell’efficacia dei farmaci biologici durante modelli di malattia in topi e forniscono approfondimenti un potenziale nuovo meccanismo di azione nelle persone. Al contrario, questo può ammoniscono contro l’uso dei farmaci biologici basati su anticorpi specifici per il trattamento di malattie infettive, soprattutto se i macrofagi svolgono un ruolo importante nella difesa dell’ospite contro l’infezione.
Introduction
I macrofagi sono cellule dell’immunità innata, che svolgono i ruoli multipli nella risposta immunitaria alle infezioni o lesioni. I macrofagi sono responsabili dell’avvio di una risposta immunitaria a danno di tessuto o di infezione, fermare la risposta infiammatoria e promuovere la guarigione di risposta1. Esempi dei tre stati di attivazione meglio studiati macrofago sono: 1) macrofagi trattati con interferone gamma (IFNγ) e lipopolisaccaride batterico (LPS), designato M (IFNγ + LPS), che contribuiscono alla risposta infiammatoria. 2) macrofagi stimolati con l’interleuchina 4 (IL-4), M(IL-4), che sono associati con la risposta di guarigione; 3) macrofagi stimolati con immunocomplessi (IC) e LPS, M (IC + LPS), che hanno la capacità di spegnere la risposta infiammatoria2,3. M (IC + LPS) sono distinti dai macrofagi di cicatrizzazione M(IL-4) e non esprimono l’arginasi enzima (Arg-1) o FIZZ14. Il miglior marcatore per questi macrofagi infiammatori è loro cytokine produzione5. I macrofagi hanno ruoli multipli nel mantenimento della salute, ma anche contribuiranno a malattie infiammatorie e cancro3. Per questo motivo, i macrofagi sono un fondamentale obiettivo terapeutico per il trattamento di un’ampia varietà di malattie. È importante studiare gli effetti degli anticorpi sul loro stato di attivazione di sviluppare trattamenti basati su macrofago per malattia.
Il focus di questa carta è sull’uso dei macrofagi del midollo osseo murino derivato (BMDMs) e macrofagi peritoneali di testare l’effetto di droghe dell’anticorpo su risposte infiammatorie in vitro e in vivo. Recentemente, ci sono stati più studi che mostrano gli effetti degli anticorpi il macrofago attivazione6,7,8. Macrofagi co-attivati con complessi immuni, che sono anticorpi complessati con un antigene e LPS, uno stimolo infiammatorio normalmente, producono livelli molto elevati della citochina antinfiammatoria IL-10 e livelli molto bassi di citochina pro-infiammatoria, interleuchina 12 (IL-12)9. Inoltre, infliximab, un anticorpo monoclonale contro il TNFα, è stato trovato a lavorare, in parte, inducendo antinfiammatori macrofagi attraverso suo frammento cristallizzabile (Fc) regione7. Abbiamo segnalato che IVIg + LPS inducono l’attivazione del macrofago antinfiammatori che è simile a M (IC + LPS), in cui co-stimolato i macrofagi producono grandi quantità di IL-10 e basse quantità della subunità citochina pro-infiammatoria Interleukin 12 o 23 p40 ( IL-12/23p40), interleukin-6 (IL-6) e TNF8. IVIg è un farmaco composto da anticorpi policlonali, principalmente IgG, che è stata riunita dal sangue di più di 1.000 donatori10. Esso è usato per trattare una vasta gamma di malattie immunologiche, come purpura thrombocytopenic idiopatico e polineuropatia demielinizzante cronica, ma il suo meccanismo d’azione non è completamente capito11. Gli effetti delle droghe dell’anticorpo basato sull’attivazione del macrofago possono essere valutati utilizzando i metodi descritti nel presente documento.
Gli effetti dei farmaci biologici specifici sull’attivazione del macrofago possono essere testati in BMDMs e macrofagi peritoneali. Utilizzando queste fonti del macrofago consente la valutazione di cellule primarie. Test preliminari di anticorpi su cellule in coltura primaria richiede meno tempo e investimento monetario rispetto ad altri modelli di malattia che richiede tempo e costoso. Iniettare una droga in un topo sano in vivoe isolando le cellule e analizzarli ex vivo, si può determinare se gli studi sono autorizzati per valutare se il trattamento con farmaci biologici colpisce l’attivazione del macrofago in modelli di malattia.
Con pochi studi test direttamente l’effetto delle terapie biologiche sul macrofago attivazione in vitro e in vivo , le nostre tecniche forniscono un vantaggio rispetto a tecniche alternative. Le attuali tecniche comportano test effetti di farmaci biologici su cellule miste popolazioni in vitro, ad esempio l’effetto di infliximab in una reazione linfocitaria mista (MLR) o IVIg su macrofagi umani in cellule mononucleari di sangue periferico, dove l’effetto non può essere attribuita a una cella specifica tipo7,12. Utilizzando BMDMs e macrofagi peritoneali è vantaggioso rispetto all’utilizzo di linee cellulari, quali le cellule RAW 264.7, che non producono le citochine pro-infiammatorie, IL-12, in risposta a LPS8,13. Verificare l’effetto di un farmaco a base di anticorpi sul macrofago risposte ex vivo ha vantaggi perché risposte di citochina possono essere attribuite direttamente ai macrofagi, piuttosto che la deduzione di risposte del macrofago misurando i livelli di citochina del siero14 . BMDMs e macrofagi peritoneali possono essere derivati e isolati da topi geneticamente modificati per determinare il ruolo specifico di una proteina in attivazione macrofagica anti-infiammatori. Ad esempio, abbiamo utilizzato Il10 carente(- / –) BMDMs per dimostrare che IVIg-indotta di riduzione della produzione di citochine pro-infiammatorie dipende parzialmente dal-108. Meccanismo di azione di un farmaco può essere studiato usando macchiarsi occidentale, dove può essere determinato il ruolo delle proteine specifiche e segnalazione eventi. Reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) può essere eseguita su BMDMs o macrofagi peritoneali di mostrare pattern di espressione genica che derivano dall’attivazione dell’anticorpo. Modelli di malattia in topi possono fornire informazioni sull’efficacia potenziale di anticorpo-ha basato le terapie biologiche nei modelli per le malattie infiammatorie intestinali malattia, artrite reumatoide ed il cancro15,16, 17. Tuttavia, le tecniche qui descritte forniranno informazioni sul meccanismo di azione di questi farmaci biologici determinando se essi inducono l’attività antinfiammatoria del macrofago.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli Stati di attivazione del macrofago svolgono un ruolo importante in entrambi di omeostasi e malattia del tessuto22. Macrofagi possono avere distinti così come sovrapposizione di Stati di attivazione, a seconda delle stecche in loro microambiente3. Hanno ruoli distinti in tutte le fasi della risposta infiammatoria: difesa contro gli agenti patogeni, ferita restituzione di tessuto e di guarigione, e hanno anche uno stato di attivazione antinfiammatori distinti che è impo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La rosa è il destinatario del premio borsa di studio laureato 4-anno fellowship (4YF) University of British Columbia. L.M.S è il destinatario di un’associazione canadese di Gastroenterologia / di Crohn e colite Canada / CIHR nuovo investigatore stipendio premio ed è uno studioso biomedica della Fondazione Michael Smith per ricerca di salute. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di progetto dal Canadian Blood Services, in collaborazione con la canadese istituti di ricerca sanitaria (concessione n # CIHR2016-LS).
Materials
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
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