マウス骨髄と腹腔マクロファージ活性化抗体を用いた薬剤効果の評価
Summary
抗体創薬が炎症性疾患の治療に革命をもたらしました。特定のターゲットに対する直接的な効果だけでなく、抗体は抗炎症になる大食細胞をアクティブ化できます。このプロトコルを記述する方法抗炎症マクロファージ活性化は評価in vitroマウス骨髄マクロファージと生体内のマクロファージを使用して使用することができます。
Abstract
マクロファージは、食細胞の自然免疫系の細胞、病原体に対する免疫応答を開始し、癒しと組織の反発に貢献。マクロファージは炎症性応答をオフにする均等に重要であります。マクロファージの免疫グロブリン (IVIg) で刺激が (IL-10)、抗炎症サイトカイン、インターロイキン 10 の多量、細菌リポ多糖 (応答のプロ炎症性サイトカインの低レベルを作り出すことができることを示したLPS)。IVIg は多価抗体は、主に免疫グロブリン (Igg)、Gs は以上 1,000 の献血者のプラズマからプールです。免疫不全症患者における抗体を補完する、または自己免疫・炎症性疾患患者の免疫応答を抑制するものです。インフリキシマブ治療抗腫瘍の壊死の要因アルファ (tnf α) 抗体は、マクロファージ炎症性の刺激への応答の IL-10 を生成するアクティブにも示されています。IVIg と他の抗体を用いた生物は、マクロファージ活性化に及ぼす影響を確認するテストできます。本稿では、派生、刺激との in vitro抗体によるマウス骨髄マクロファージと抗体の生体内で活性化マウス腹腔マクロファージの評価法について説明します。最後に、我々 は特定の細胞シグナル伝達に抗炎症マクロファージ活性経路の寄与を決定する西部にしみが付く使用を示します。これらのプロトコルは、特定の蛋白の抗炎症マクロファージ活性化に及ぼす影響を決定する遺伝子改変マウスを使用できます。これらのテクニックは、特定生物製剤は大食細胞を炎症反応で生体を減らす IL 10 生産抗炎症活性化状態に変更することにより行動できるかどうかを評価するためにも使用できます。これはマウスの病態モデルの中に生物学的製剤の有効性のマクロファージ活性化の役割に関する情報を提供し、人々 の行動の潜在的な新しいメカニズムへの洞察力を提供できます。逆に、これに警告するかもしれない特定抗体を用いた生物学的製剤の使用に対して感染症を治療するためにマクロファージがその感染に対する宿主防御において重要な役割を果たす場合に特に。
Introduction
大食細胞は自然免疫系細胞、感染症やけがに免疫応答における複数の役割を果たすです。マクロファージは、感染、組織の損傷に免疫応答を開始する、炎症性応答を停止、治癒反応1を推進します。3 つの最適勉強マクロファージ活性化状態の例としては、: 1) マクロファージがインターフェロン γ (肝腎) と細菌リポポリサッカライド (LPS)、炎症性応答に貢献する M (肝腎 + LP) を指定2) マクロファージ インターロイキン 4 (IL-4)、M(IL-4)、刺激治療の応答に関連付けられています。3) マクロファージ免疫複合体 (IC) で刺激や LP、M (IC + LP)、炎症性応答の2,3を無効にする能力を持っています。M (IC + LP) M(IL-4) 治癒マクロファージ、異なっているし、酵素アルギナーゼ (Arg-1) または FIZZ14を表現しないでください。これらの抗炎症マクロファージの最高のマーカーは、そのサイトカイン生産5です。マクロファージは、健康を維持するために複数のロールを持つが、炎症性疾患やがん3にも貢献。このため、マクロファージが様々 な疾患の治療のためキーの治療上のターゲットです。抗体マクロファージによる疾患治療法の開発に、活性化状態を検討することが重要です。
本稿の焦点はマウス骨髄由来マクロファージ (BMDMs) とマクロファージ炎症性応答体外と体内に抗体医薬の効果をテストするための使用です。最近、マクロファージ活性化6,7,8抗体の効果を示す複数の調査がずっとあります。共同のマクロファージ免疫複合体、抗体抗原および LP、通常炎症性刺激との複合体であると抗炎症サイトカイン、IL-10、およびプロ炎症性サイトカインの非常に低レベルの非常に高いレベルを生成します。インターロイキン 12 (IL-12)9。また、インフリキシマブ、tnf α、抗体、一部、そのフラグメント結晶 (Fc) 地域7を介して抗炎症大食細胞を誘導することによって動作するように発見されています。我々 は IVIg + LP が m (IC + LP)、共同誘導マクロファージが大量の IL-10 およびプロ炎症性サイトカイン サブユニット インターロイキン 12 の 23 p40 (少量を生成する前記のような抗炎症マクロファージの活性化を誘導することを報告しています。IL-12/23p40)、インターロイキン-6 (IL-6)、および TNF8。IVIg は、1,000 以上のドナー10の血からプールされて主に IgG ポリクローナル抗体から成る薬です。さまざまな慢性的な脱髄性多発性神経障害、特発性血小板減少性紫斑病などの免疫疾患の治療に使用されますが、その作用メカニズムは完全に理解11ではないです。マクロファージ活性化に基づく抗体医薬の効果は、ここに説明する方法を使用して評価できます。
BMDMs と腹腔マクロファージ マクロファージ活性化の特定の生物学的製剤の効果をテストできます。これらのマクロファージのソースを使用すると、一次電池の評価ができます。培養細胞における抗体の予備的なテストより少ない時間と他の時間がかかり、高価な疾患モデルよりも金銭的投資が必要です。健康なマウス生体内で薬を注入すると細胞を分離する前のヴィヴォそれらを分析、研究、生物学的製剤による治療疾患モデルにおけるマクロファージ活性化に影響を与えるかどうかを評価するために保証されているを決定できます。
マクロファージ活性化in vitroとin vivoでの生物学的製剤の効果を直接テストいくつかの研究は、当社の技術は代替技術上の優位性を提供します。現在の技術を含む混合細胞集団の in vitro、ひと末梢血単核細胞、マクロファージにリンパ球混合培養反応 (MLR) や IVIg におけるインフリキシマブの効果などに対するテストの生物学的薬剤の効果、効果特定のセル型7,12に起因することはできません。炎症性サイトカインを生成しない、RAW264.7 細胞など細胞株を使用してで有利である BMDMs および腹腔マクロファージを用いた IL-12 組合8,13に対応。血清サイトカイン レベル14 を測定することによって大食細胞の応答を推定のではなく、サイトカインは、マクロファージに直接帰することができるので利点がありますマクロファージ反応前のヴィヴォにおよぼす抗体創をテスト.BMDMs と腹腔マクロファージを派生し、抗炎症のマクロファージ活性化におけるタンパク質の特定の役割を決定する遺伝子組み換えマウスから分離できます。たとえば、 Il10欠乏を使いました(-/-) BMDMs IVIg がプロ炎症性サイトカイン産生の還元反応は IL-108に部分的に依存します。薬の作用機序は、ウェスタンブロット、特定の蛋白質のシグナル伝達における役割を決定ことができますを使用して調べることができます。BMDMs または腹腔マクロファージ活性化抗体に起因する遺伝子発現のパターンを表示するには、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) を実行できます。マウスの病態モデルは炎症性腸疾患、関節リウマチ、癌15,16,のような病気のモデルで抗体を用いた生物学的治療の潜在的な有効性に関する情報を提供できます。17します。 ただし、ここで説明する方法に関する情報を提供これらのバイオ医薬品の作用機序彼らは抗炎症マクロファージ活性を誘導するかどうかを決定することによって。
Protocol
Representative Results
Discussion
マクロファージ活性化状態は、恒常性と疾患22を組織と両方で重要な役割を果たします。マクロファージはその微小環境3の手掛かりによって、アクティブ化の状態の重複だけでなく、個別に持つことができます。炎症性応答のすべての段階に個別の役割がある: 病原体に対する防衛、創傷治癒と組織の反発、また炎症性応答2 をオフにすること…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.K. は、ブリティッシュ ・ コロンビアの大学 4 年間奨学金 (4YF) 大学院学生の身分賞の受信者です。L.M.S. は消化器のカナダの協会の受信者/クローン病、大腸炎カナダされて新しい調査官給与賞/健康研究、生物医学学者マイケル ・ スミス財団。この作品は、(# CIHR2016 LS を付与) 健康研究のカナダの協会と共同でカナダの血サービスからプロジェクトの助成金によって支えられました。
Materials
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
References
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