Vurdering av antistoff-baserte narkotika effekter på Murine benmargen og Peritoneal Macrophage aktivisering
Summary
Antistoff-baserte narkotika har revolusjonert behandling for akutt. I tillegg til å ha direkte virkninger på konkrete mål, kan antistoffer aktivere makrofager å bli anti-inflammatorisk. Denne protokollen beskriver hvordan anti-inflammatorisk macrophage aktivisering kan vurderes i vitro, bruke musen benmarg makrofager og i vivo, bruker peritoneal makrofager.
Abstract
Makrofager er phagocytic medfødte immunceller, som starte immunreaksjoner mot patogener og bidra til healing og vev hvile. Makrofager er like viktig i å slå av inflammatoriske svar. Vi har vist at makrofager stimulert med intravenøs immunglobulin (IVIg) kan produsere store mengder anti-inflammatorisk cytokin, interleukin 10 (IL-10) og lave nivåer av pro-inflammatoriske cytokiner svar på bakteriell lipopolysaccharides ( LPS). IVIg er et polyvalent antistoff, hovedsakelig immunglobulin Gs (IgGs), samlet fra plasma av mer enn 1000 blodgivere. Det brukes til å supplere antistoffer hos pasienter med immun mankoen eller undertrykke immunreaksjoner hos pasienter med autoimmune eller inflammatoriske tilstander. Infliximab, en terapeutisk anti-svulst necrosis faktor alpha (TNFα) antistoff, har også vært vist å aktivere makrofager å produsere IL-10 Svar på inflammatorisk stimuli. IVIg og andre antistoff-baserte biologiske kan testes for å finne deres effekter på macrophage aktivisering. Dette dokumentet beskriver metodene for avledning, stimulering og vurdering av murine benmarg makrofager aktiveres av antistoffer i vitro og murine peritoneal makrofager aktiveres med antistoffer i vivo. Til slutt, viser vi bruk av vestlige blotting for å finne ut bidrag av bestemt celle signalnettverk trasé til anti-inflammatorisk macrophage aktivitet. Disse protokollene kan brukes med genmodifiserte mus, for å fastslå effekten av en bestemt protein(s) på anti-inflammatorisk macrophage aktivisering. Disse teknikkene kan også brukes til å vurdere om bestemte biologiske kan handle ved å endre makrofager til en IL-10-produserende antiinflammatoriske aktivisering situasjon som reduserer inflammatorisk svar i vivo. Dette kan gi informasjon om rollen til macrophage aktivering i effekten av biologiske under sykdom modeller i mus og gi innsikt i en potensiell ny virkningsmekanisme i mennesker. Derimot kan dette forsiktig mot bruk av spesifikke antistoffer-baserte biologiske å behandle smittsomme sykdommer, spesielt hvis makrofager spille en viktig rolle i vert forsvar mot at infeksjon.
Introduction
Makrofager er medfødte immunceller, som spiller flere roller i immunforsvaret infeksjon eller skade. Makrofager er ansvarlig for igangsetting en immunrespons på infeksjon eller vev skade stoppe inflammatorisk respons og fremmer healing respons1. Eksempler på de tre beste studerte macrophage aktivisering statene er: 1) makrofager behandles med interferon-gamma (IFNγ) og bakteriell lipopolysakkarid (LPS), utpekt M (IFNγ + LPS), som bidrar til betennelsesreaksjon; 2) makrofager stimulert med interleukin 4 (IL-4), M(IL-4), som er forbundet med healing respons; 3) makrofager stimulert med immun komplekser (IC) og LPS, M (IC + LPS), som har muligheten til å deaktivere betennelsesreaksjon2,3. M (IC + LPS) er atskilt fra M(IL-4) sårheling makrofager og uttrykke ikke enzym arginase (Arg-1) eller FIZZ14. Beste indikator for disse anti-inflammatorisk makrofager er deres cytokin produksjon5. Makrofager har flere roller i å opprettholde helse, men også bidra til inflammatoriske sykdommer og kreft3. Derfor er makrofager en nøkkel terapeutisk mål for behandling av en rekke sykdommer. Det er viktig å undersøke effekten av antistoffer på deres aktivisering begrunne å utvikle macrophage-baserte behandlinger for sykdom.
Fokus for denne utredningen er om bruk av murine benmarg avledet makrofager (BMDMs) og peritoneal makrofager å teste effekten av antistoff narkotika på inflammatorisk svar i vitro og i vivo. Nylig har det vært flere undersøkelser viser effekten av antistoffer macrophage aktivisering6,7,8. Makrofager co aktiveres med immun komplekser, som antistoffer kompleksbundet med et antigen og LPS, en normalt inflammatorisk stimulans, produsere svært høye nivåer av anti-inflammatorisk cytokin, IL-10 og svært lave nivåer av pro-inflammatoriske cytokin, interleukin 12 (IL-12)9. I tillegg, infliximab, et monoklonalt antistoff mot TNFα, har blitt funnet for å arbeide, delvis ved å fremkalle anti-inflammatorisk makrofager gjennom sin fragment crystallizable (Fc) region7. Vi har rapportert at IVIg + LPS føre anti-inflammatorisk macrophage aktivisering som ligner M (IC + LPS), hvor co stimulert makrofager produsere store mengder IL-10 og små mengder av pro-inflammatoriske cytokin delenhet Interleukin 12 eller 23 p40 ( Il-12/23p40), interleukin-6 (IL-6) og TNF8. IVIg er et stoff består av polyklonale antistoffer, hovedsakelig IgG, som har blitt samlet fra blodet av mer enn 1000 givere10. Den brukes til å behandle en rekke immunologiske sykdommer, som idiopatisk thrombocytopenic purpura og kronisk demyeliniserende Polynevropati, men dens virkningsmekanismen er ikke helt forstått11. Effekten av antistoff basert narkotika på macrophage aktivisering kan vurderes ved hjelp av metodene beskrevet heri.
Effekten av bestemte biologiske på macrophage aktivisering kan testes i BMDMs og peritoneal makrofager. Med disse macrophage kilder tillater vurdering av primære celler. Innledende testing av antistoffer på kulturperler primære celler krever mindre tid og investering penge enn andre tidkrevende og kostbar sykdom modeller. Sprøytebruk i en sunn musen i vivo, og isolere cellene og analysere dem ex vivo, kan en finne ut hvis studier er garantert for å vurdere om behandling med biologiske påvirker macrophage aktivering i sykdom modeller.
Noen studier teste effekten av biologiske terapier på macrophage aktivisering i vitro og i vivo direkte, gir våre teknikker en fordel over alternative teknikker. Gjeldende teknikker involvere testing biologiske stoffet effekter på mikset-celle populasjoner i vitro, for eksempel effekten av infliximab i en blandet lymfocytt reaksjon (MLR) eller IVIg på menneskelig makrofager i perifert blod mononukleære celler, hvor effekten ikke kan tilskrives en bestemt celle type7,12. Bruke BMDMs og peritoneal makrofager er en fordel over bruker linjer, for eksempel RAW264.7 celler som ikke produserer den pro-inflammatoriske cytokin, IL-12, som svar på LPS8,13. Teste effekten av et antistoff-baserte narkotika på macrophage svar ex vivo har fordeler fordi cytokin svar kan direkte tilskrives makrofager, snarere enn inferring macrophage svar ved å måle serum cytokin nivåer14 . BMDMs og peritoneal makrofager kan være avledet og isolert fra genmodifiserte mus å fastslå den spesifikke-rollen til en protein i anti-inflammatorisk macrophage aktivisering. For eksempel vi har brukt Il10 mangelfull(- / –) BMDMs å vise at IVIg-indusert reduksjon av pro-inflammatoriske cytokiner produksjonen er delvis avhengig av IL-10-8. Stoffets virkningsmekanismen kan undersøkes med vestlige blotting, der rollen spesifikke proteiner og signalnettverk hendelser kan bestemmes. Kvantitativ polymerasekjedereaksjons (qPCR) kan utføres på BMDMs eller peritoneal makrofager å vise mønstre av genuttrykk som følge av antistoff aktivisering. Sykdom modeller i mus kan gi informasjon om den potensielle effekten av antistoff-baserte biologiske terapier modeller for sykdommer som inflammatorisk tarm sykdom, revmatoid artritt og kreft15,16, 17. men teknikkene her vil gi informasjon om virkningsmekanismen av disse biologiske ved å bestemme om de induserer anti-inflammatorisk macrophage aktivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Macrophage aktivisering USA spiller en viktig rolle i begge vev homeostase og sykdom22. Makrofager kan ha forskjellige og overlappende aktivisering stater, avhengig av signaler i deres microenvironment3. De har forskjellige roller i alle faser av inflammatorisk respons: forsvar mot patogener sår helbredelse og vev hvile og har også en tydelig anti-inflammatorisk aktiveringsstatus som er viktig for å slå av inflammatorisk respons2 . Anti-inflammat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.K. er University of British Columbia 4 års fellesskap (4YF) graduate studentship pris. L.M.S. er mottakeren av en kanadisk sammenslutning av gastroenterologi / Crohns og kolitt Canada / CIHR nye etterforsker lønn prisen og biomedisinsk forsker Michael Smith Foundation for Health Research. Dette arbeidet ble støttet av et prosjekt stipend fra Canadian blod tjenester, i samarbeid med den kanadiske institutter for helseforskning (gi # CIHR2016-LS).
Materials
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13 (2014).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
- Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
- Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
- Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777 (2013).
- Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, 10-20 (1996).
- Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
- Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
- Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
- Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
- Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
- Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160 (2014).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
- Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
- Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
- Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins–understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, 2-13 (2009).
- Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
- Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).
