Bedömning av antikroppsläkemedel effekter på murina benmärg och Peritoneal makrofag aktivering
Summary
Antikroppsbaserade läkemedel har revolutionerat behandling av inflammatoriska sjukdomar. Förutom att ha direkta effekter på specifika mål, kan antikroppar aktivera makrofager att bli antiinflammatoriska. Det här protokollet beskriver hur antiinflammatoriska makrofag aktivering kan vara bedömda in vitro använder mus benmärgen makrofager, och in vivo med peritoneal makrofager.
Abstract
Makrofager är fagocytos innate immuna celler, som inleda immunsvar mot patogener och bidra till läkning och vävnad restitution. Makrofager är lika viktiga i att stänga av inflammatoriskt svar. Vi har visat att makrofager stimuleras med intravenöst immunglobulin (IVIg) kan producera stora mängder av den anti-inflammatorisk cytokin, interleukin 10 (IL-10) och låga nivåer av proinflammatoriska cytokiner som svar till bakteriella lipopolysackarider ( LPS). IVIg är en polyvalenta antikropp, primärt immunglobulin Gs (IgG), poolade av plasma från mer än 1 000 blodgivare. Det används för att komplettera antikroppar hos patienter med immunbrister eller undertrycka immunsvaret hos patienter med autoimmuna eller inflammatoriska tillstånd. Infliximab, en terapeutisk anti-tumör nekros faktor alpha (TNFα) antikropp, har också visat att aktivera makrofager att producera IL-10 svar på inflammatoriska stimuli. IVIg och andra antikroppsbaserade biologics kan testas för att fastställa deras effekter på makrofag aktivering. Detta dokument beskriver metoder för härledning, stimulering och bedömning av murina benmärgen makrofager aktiveras av antikroppar i vitro och murina peritoneal makrofager aktiveras med antikroppar i vivo. Slutligen visar vi användningen av western blotting för att fastställa bidraget av viss cell signalering vägar till antiinflammatoriska makrofag aktivitet. Dessa protokoll kan användas med genetiskt modifierade möss, för att avgöra effekten av en specifik proteinernas på antiinflammatoriska makrofag aktivering. Dessa tekniker kan också användas för att bedöma om specifika biologics får agera genom att ändra makrofager till en IL-10-producerande antiinflammatoriska aktiveringsläge som minskar inflammatoriskt svar i vivo. Detta kan ge information om rollen av makrofag aktivering i effekten av biologiska läkemedel under sjukdomsmodeller hos möss, och ge inblick i en potentiell ny verkningsmekanism i människor. Däremot kan detta varning mot användning av specifika antikroppsbaserade biologics att behandla infektionssjukdomar, särskilt om makrofager spela en viktig roll i värd försvar mot att infektion.
Introduction
Makrofager är innate immuna celler, som spela flera roller i immunförsvaret till infektion eller skada. Makrofager är ansvariga för inleda ett immunsvar mot infektion eller vävnad skada, stoppa den inflammatoriska reaktionen och att främja helande svar1. Exempel på de tre bästa studerade makrofag aktiveringen staterna är: 1) makrofager som behandlats med interferon gamma (IFNγ) och bakteriella lipopolysackarid (LPS), designerat M (IFNγ + LPS), som bidrar till den inflammatoriska reaktionen; (2) makrofager stimuleras med interleukin 4 (IL-4), M(IL-4), som är associerade med den helande reaktion; (3) makrofager stimuleras med immunkomplex (IC) och LPS, M (IC + LPS), som har förmågan att stänga av den inflammatoriska reaktion2,3. M (IC + LPS) skiljer sig från M(IL-4) sårläkning makrofager och uttrycker inte den enzym arginas (Arg-1) eller FIZZ14. Den bästa markören för dessa antiinflammatoriska makrofager är deras cytokin produktion5. Makrofager har flera roller att upprätthålla hälsa, men också bidra till inflammatoriska sjukdomar och cancer3. På grund av detta är makrofager viktiga terapeutiska mål för behandling av en mängd olika sjukdomar. Det är viktigt att undersöka effekterna av antikroppar på deras aktiveringsläge att utveckla makrofag-baserade behandlingar för sjukdom.
Denna uppsats fokuserar på användning av murina benmärgen härrör makrofager (BMDMs) och peritoneal makrofager att testa effekten av antikroppar läkemedel på inflammatoriskt svar in vitro och in vivo. Nyligen har det varit flera studier som visar effekterna av antikroppar på makrofag aktiveringen6,7,8. Makrofager aktiveras tillsammans med immunkomplex, som är antikroppar komplexförening med antigen och LP-skivor, ett normalt inflammatoriskt stimulus, halter mycket höga av antiinflammatoriska cytokiner, IL-10 och mycket låga nivåer av de pro-inflammatorisk cytokin, interleukin 12 (IL-12)9. Dessutom, infliximab, en monoklonal antikropp mot TNFα, har visat sig fungera, delvis genom att inducera antiinflammatoriska makrofager genom dess fragment crystallizable (Fc) region7. Vi har rapporterat att IVIg + LPS inducerar antiinflammatoriska makrofag aktivering som liknar M (IC + LP-skivor), vari Co stimuleras makrofager producerar stora mängder IL-10 och låga mängder av pro-inflammatorisk cytokin subenhet Interleukin 12 eller 23 p40 ( Il-12/23p40), interleukin-6 (IL-6) och TNF8. IVIg är ett läkemedel som består av polyklonala antikroppar, primärt IgG, som har slagits samman från mer än 1000 givare10blod. Det används för att behandla en mängd olika immunologiska sjukdomar som idiopatisk trombocytopen purpura och kronisk demyeliniserande polyneuropati, men verkningsmekanismen är inte helt förstått11. Effekterna av antikropp baserat droger på makrofag aktivering kan bedömas med metoderna som beskrivs häri.
Effekterna av särskilda biologics på makrofag aktivering kan testas i BMDMs och peritoneal makrofager. Använda dessa makrofag källor tillåter bedömning av primära celler. Preliminär testning av antikroppar på odlade primära celler kräver mindre tid och monetär investering än andra tidskrävande och dyra sjukdomsmodeller. Genom att injicera en drog i en hälsosam mus i vivo, och isolera cellerna och analysera dem ex vivo, kan man bestämma om studier är berättigade för att bedöma om behandling med biologiska läkemedel påverkar makrofag aktivering i sjukdomsmodeller.
Med några studier testa effekten av biologiska behandlingar på makrofag aktivering in vitro och in vivo direkt, ger våra tekniker en fördel jämfört med alternativa tekniker. Aktuella tekniker innebär testning biologiska läkemedelseffekter på blandad cell populationer i vitro, till exempel effekten av infliximab hos en blandade lymfocyter reaktion (MLR) eller IVIg på mänskliga makrofager i perifera mononukleära blodceller, där effekten inte kan hänföras till en viss cell typ7,12. Använda BMDMs och peritoneal makrofager är fördelaktiga över med cellinjer, såsom RAW264.7 celler, som inte producerar den pro-inflammatoriska cytokin, IL-12, svar till LPS8,13. Testa effekten av en antikroppsbaserade läkemedel på makrofag Svaren ex vivo har fördelar eftersom cytokin svar kan hänföras direkt till makrofager, snarare än inferring makrofag Svaren genom att mäta nivåerna av serum cytokin14 . BMDMs och peritoneal makrofager kan härledas och isolerad från genetiskt modifierade möss att bestämma den särskilda rollen som ett protein i antiinflammatoriska makrofag aktivering. Till exempel har vi använt Il10 bristfällig(- / –) BMDMs att påvisa att IVIg-inducerad minskning av pro-inflammatorisk cytokin produktion är delvis beroende av IL-108. En läkemedlets verkningsmekanism kan undersökas med hjälp av western blotting, där rollen av specifika proteiner och signalering händelser kan fastställas. Kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR) kan utföras på BMDMs eller peritoneal makrofager att Visa beskrivningar av genuttryck som följd av antikropp aktivering. Sjukdomsmodeller hos möss kan ge information om den potentiella effekten av antikroppsbaserade biologiska terapier i modeller för sjukdomar som upphetsande läkt sjukdom, reumatoid artrit och cancer15,det16, 17. men de tekniker som beskrivs här ger information om verkningsmekanismen av dessa biologiska läkemedel genom att bestämma huruvida de inducerar antiinflammatoriska makrofag aktivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Makrofag aktiveringen stater har en viktig roll i både vävnad homeostas och sjukdom22. Makrofager kan ha skilda samt överlappande aktiveringen staterna, beroende på ledtrådar i sin mikromiljö3. De har skilda roller i alla stadier av det inflammatoriska svaret: försvar mot patogener, sår läkning och vävnad restitution och har också en distinkt antiinflammatoriska aktiveringen stat som är viktigt för att stänga av den inflammatoriska reaktionen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Larsson är mottagare av utmärkelsen University of British Columbia 4-årig fellowship (4YF) graduate STUDENTTILLVARO. L.M.S. är mottagare av en Canadian Association i gastroenterologi / Crohns och kolit Kanada / CIHR nya utredare lön Award och är en biomedicinsk vetenskapsman av stiftelsen Michael Smith för hälsoforskning. Detta arbete stöds av ett projektanslag från kanadensiska blod tjänster, i samarbete med den kanadensiska institut för hälsa forskning (bevilja # CIHR2016-LS).
Materials
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13 (2014).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
- Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
- Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
- Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777 (2013).
- Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, 10-20 (1996).
- Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
- Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
- Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
- Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
- Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
- Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160 (2014).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
- Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
- Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
- Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins–understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, 2-13 (2009).
- Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
- Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).
