과도 식의 외국 유전자 단백질 기능 분석 결과 대 한 곤충 세포 (sf9)
Summary
이 프로토콜 열 충격 유발 단백질 식 시스템 (pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템), 외국 단백질을 표현 하거나 안티 apoptotic 활동의 잠재적인 외국 단백질 및 그들의 잘린 아미노 평가에 사용 될 수 있는 설명 곤충 세포에서 산입니다.
Abstract
변이 유전자 표현 시스템 잠재 체 외에서 세포 문화 시스템에서 단백질 기능 분석을 수행 하기 위한 가장 중요 한 기술 중 하나입니다. 이 시스템은 과도 식 플라스 미드에 baculoviral 발기인의 통제 익스프레스 외국 유전자를 개발 되었다. 또한,이 시스템은 자체 잠재 또는 외국 단백질 기능 분석 결과에 적용할 수 있습니다. 가장 광범위 하 게 그리고 상업적으로 사용 가능한 변이 유전자 식 시스템 Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV)의 즉시 이른 유전자 (IE) 발기인에 따라 개발 된다. 그러나, 낮은 식 수준 외국 유전자 곤충 세포에서 관찰 되었다. 따라서, 일시적인 유전자 표현 시스템 단백질 식 향상을 위한 건설 되었다. 이 시스템에서 재조합 플라스 미드는 초파리 열 충격 70 (Dhsp70) 발기인의 통제 대상 시퀀스를 포함 하도록 건설 되었다. 이 프로토콜의이 열 충격 기반 pDHsp/V5-그의 (6 히스티딘와 V5 epitope) 응용 프로그램 선물 /Spodoptera frugiperda 셀 (sf9 셀) 시스템; 이 시스템은 또한 곤충 세포에서 후보 단백질의 안티-apoptotic 활동을 평가 하기 위한 유전자 발현 뿐만 아니라 가능 하다. 또한,이 시스템 중 한 재조합 플라스 미드와 페 수 또는 두 개의 잠재적으로 기능적으로 대립 곤충 세포에서 재조합 플라스 미드를 페 공동. 프로토콜이이 시스템의 효율성을 설명 하 고이 기술의 실용적인 사례를 제공 합니다.
Introduction
두 단백질 표정 시스템 단백질 생산을 위해 일반적으로 사용 되었습니다: 원핵생물 단백질 표정 시스템 (대장균 유전자 표현 시스템) 및 진핵생물 단백질 표정 시스템. 하나의 인기 있는 진핵생물 단백질 식 시스템은 잠재 식 벡터 시스템 (BEVS)1. Baculoviruses 먼저 농업의 전세계 생물 관리 요원으로 사용 되었다 산림 해충 및. 지난 몇 년간, baculoviruses 단백질 표정 벡터도를 위한 바이오 도구로 개발 되었다. 더블-좌초 원형 DNA 및 엔벌로프된 nucleocapsids2baculoviruses의 게놈에 의하여 이루어져 있다. 날짜 하려면, seventy-eight 잠재 이상 격리 시퀀스3되었습니다. 호스트 곤충 세포에서 baculoviral 유전자 식의 시간적 cascade를 바탕으로, 유전자 전사 4 시간 계곡, 즉시 초기 지연-초기, 늦은, 그리고 매우 늦은 유전자4등으로 분류 될 수 있습니다.
매우 늦은 유전자 발기인 (즉, 다면체 또는 p10 발기인) 대상 유전자 재조합 잠재 동종 재결합에 의해 생성 하는 동안 운전 하는 데 사용 되었다 BEVSs 지정 되었다. 재조합 잠재 하 여 곤충 세포에서 외국 단백질의 표정은 포유류 단백질 (당단백질 생산에 적합 한) 포스트 번역 상 수정에서의 비슷합니다. 따라서,는 잠재 널리5,,67되었습니다. 그러나, 한 가지 한계 곤충 세포7다른 N glycosylation 통로의 존재입니다.
따라서, 새로운 잠재 식 시스템, 변이 유전자 표현 시스템 개발 되었다. 이 시스템은 곤충 세포에서 baculoviral 즉시 초기 발기인 (발기인즉-1 )의 드라이브에서 외국 유전자를 표현합니다. 이 시스템을 사용 하 여 대상 단백질 표현할 수 있습니다 즉시 즉-1 발기인의 통제에 곤충 세포에서 N glycosylation 통로 더 나은 N 연결 oligosaccharides7에 결과 수정 하는 동안. 또한, baculoviral 즉시 이른 유전자 호스트 세포 RNA 중 합 효소 II에 의해 복사할 수 있습니다 그리고 어떤 바이러스 성 요인 활성화4에 대 한 필요 하지 않습니다. 따라서, 외국 단백질 곤충 세포는 짧은 시간 내에 표현할 수 있습니다. 날짜 하려면, 과도 유전자 표현 시스템 잠재 체 외에서 세포 문화 시스템에서 단백질 기능 분석을 수행 하기 위한 가장 중요 한 기술 중 하나입니다. 잠재 또는 외국 단백질의 기능을 분석 하는 시스템을 적용할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 변이 유전자 표정 시스템 중 하나는 Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 및 OpIE1 발기인)의 즉시 이른 유전자 (IE) 발기인을 기반으로 합니다.
그러나, 곤충 세포에서 외국 유전자의 식 저수준은 여전히 문제가 OpIE 과도 유전자 발기인 기반 식 시스템은 사용된8,,910. 따라서, 다른 변이 유전자 표현 시스템 초파리 열 충격 단백질 70 (hsp70) 유전자8,9발기인에 따라 건설 되었다. H s p 70의 발기인 baculoviral IE 발기인 곤충 세포10열 충격에 의해 유도 된 때 보다 더 효율적으로 작동 합니다. 이 시스템에서 대상 유전자는 초파리 열 충격 70 (Dhsp70) 발기인의 드라이브에서 표현 되었다. 외국 유전자 PCR 기반 복제 방법으로 일시적인 유전자 식 플라스 미드에 쉽게 복제 수 있습니다. 또한, 열 충격 유도 의해 유전자 발현에 대 한 타이밍의 제어를 수행할 수 있습니다.
이 보고서에서 우리는 접근 따르고 (apoptosis 3의 억제 물, iap3 Lymantria xylina MNPV에서에서) baculoviral 유전자의 3 개의 다른 잘림 열 충격에 기초를 둔 일시적인 단백질 식 시스템을 사용 하 여 표현 하 고 추가 안티-apoptotic 활동 분석에이 표현한 단백질을 적용 합니다. 이 시스템 수 중 외국 단백질 신속 하 게 또는 또한 다른 단백질 활동 분석 실험에 적용할 가능성을 하면서 sf9 세포에서 단백질 안티 apoptotic 활동의 평가에 적용할 추가.
Protocol
Representative Results
Discussion
열 충격 기반 pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템의 개념 처음 클레 멘 타인 외. 19948에 의해 설명 되었다. Baculoviral 유전자 발기인 (IE1)와 초파리 hsp70 의 비교는 hsp70 모기 셀10높은 효율을 했다 보여주었다. 또한, 열 충격 유도 때문 단백질 식의 타이밍은 열 충격 처리 후 정확 하 게 제어할 수 수 있습니다. 이 시스템은 다음 새우와 nucleopolyhedroviru…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 박사 지 앤 Horng 레이 연구소의 해양 생물학과, 국립 대만 해양 대학 3 플라스 미드 구조물을 제공 하기 위한 감사 합니다. 이 연구에 의해 그랜트 106-2311-B-197-001-과학의 부 및 기술 (대부분)에서 지원 되었다.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
References
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