Переходных выражение иностранных генов в клетках насекомых (sf9) для функциональных Assay протеина
Summary
Этот протокол описывает тепла шок индуцированного белка выражение (система pDHsp/V5-его/sf9 клеток), который может использоваться для выражения инородные белки или оценке анти apoptotic деятельность потенциальных иностранных белков и их усеченного аминокислот кислоты в клетках насекомых.
Abstract
Переходных ген выражение системы является одним из наиболее важных технологий для выполнения функционального анализа белка в бакуловирусы в vitro клетки культуры системы. Эта система была разработана для Экспресс чужеродные гены под контролем промотора baculoviral в переходных выражение плазмид. Кроме того эта система может применяться для функционального анализа бакуловирусы сам или инородные белки. Наиболее широко и коммерчески доступных временных ген выражение системы является разработана на основе незамедлительного начала гена (IE) промоутер Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Однако наблюдается низкий уровень экспрессии чужеродных генов в клетках насекомых. Таким образом выражение системы переходных ген был построен для улучшения выражения протеина. В этой системе были построены рекомбинантных плазмид содержат последовательности целевых объектов под контролем промотора дрозофилы теплового шока 70 (Dhsp70). Этот протокол представляет применение этого тепла на основе шок pDHsp/V5-его (V5 epitope с 6 гистидина) /Spodoptera frugiperda клетки (клетки sf9) системы; Эта система доступна не только для экспрессии генов, но и для оценки активности анти apoptotic кандидата белков в клетках насекомых. Кроме того эта система либо transfected с одной рекомбинантных плазмид или совместно transfected два потенциально функционально антагонистических рекомбинантных плазмид в клетках насекомых. Протокол демонстрирует эффективность этой системы и обеспечивает практический случай этой техники.
Introduction
Две системах выражения протеина широко использовались для производства белков: системах выражения протеина прокариот (кишечная палочка ген выражение системы) и эукариоты системах выражения протеина. Один из популярных эукариоты системе выражения протеина является бакуловирусы выражение вектор системы (BEVS)1. Baculoviruses впервые были использованы как во всем мире биоконтролирующих агентов сельскохозяйственных и лесных вредителей. В последние несколько десятилетий как биотехнологические инструменты для векторов выражения протеина также были разработаны baculoviruses. Геномы baculoviruses состоят из круговой двуцепочечной ДНК и запечатанная nucleocapsids2. На сегодняшний день, более чем семьдесят бакуловирусы изолятов были виртуализированного3. На основании временной Каскад выражения гена baculoviral в клетки хозяина насекомых, транскрипции гена могут быть разделены на четыре временных каскады, включая немедленное ранний, задержка начале, конце и очень поздно гены4.
BEVSs были определены таким образом, что очень поздно генным стимуляторам (то есть, многогранник или p10 промоутер) были использованы для привода целевых генов, в то время как рекомбинантной бакуловирусы была порождена гомологичная рекомбинация. Выражение иностранных белков в клетках насекомых, рекомбинантных бакуловирусы похож на млекопитающих белков в столб-поступательные изменения (подходит для производства гликопротеин). Таким образом бакуловирусы был широко используется5,6,7. Однако одно ограничение является наличие различных путей N-гликозилирования насекомых клетки7.
Таким образом была разработана новая система бакуловирусы выражение, выражение системы переходных гена. Эта система выражает чужеродные гены под диск baculoviral немедленного начале промоутеров (ie-1 промоутер) в клетках насекомых. С помощью этой системы, целевого белка может быть сразу же выражена под контролем промотора ie-1 во время изменения N-гликозилирования путь в клетках насекомых, что приводит к лучшей олигосахариды, связанный с N7. Кроме того baculoviral немедленно ранняя гены транскрибируются РНК полимеразой II клетки-хозяина и не требуют какой-либо вирусной фактор для активации4. Таким образом иностранные белков может быть выражено в клетках насекомых в течение короткого времени. На сегодняшний день, переходные системы выражения гена является одним из наиболее важных технологий для выполнения функциональных анализов белка в бакуловирусы в vitro клетки культуры системы. Система может применяться для анализа функции бакуловирусы или инородные белки. Один из коммерчески доступных временных ген выражение систем основана на промоутеров немедленного начала гена (IE) Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 и OpIE1 промоутеров).
Однако ниже уровень экспрессии чужеродных генов в клетках насекомых еще была проблема, когда система выражение на основе промоутер переходных гена OpIE была используется8,9,10. Таким образом другой переходных ген выражение системы была построена на основе промоутер дрозофилы тепловой шок белка 70 (БТШ70) ген8,9. Промоутер hsp70 работает более эффективно, чем промоутер baculoviral IE когда индуцированных теплового шока на насекомых клетки10. В этой системе были высказаны генов-мишеней под диск промотора дрозофилы теплового шока 70 (Dhsp70). Чужеродные гены можно легко клонировать в плазмиду выражение переходных генов клонирования методами на основе ПЦР. Кроме того контроль сроков для экспрессии генов может осуществляться тепловой шок индукция.
В настоящем докладе, мы следовать подходу и выразить три различных усечений гена baculoviral (Ингибитор апоптоза 3, iap3 от Lymantria xylina MNPV) с помощью системы выражения на основе шок переходных белка тепла и Далее примените эти выраженной белки на анти apoptotic анализ деятельности. Эта система может либо Экспресс инородные белки быстро или применяться для оценки деятельности анти apoptotic белка в клетках sf9, а также может применяться для других анализов активность белка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Концепция системы тепла на основе шок клеток pDHsp/V5-его/sf9 был впервые описан Клем et al. 19948. Сравнение baculoviral гена промоутер (IE1) и дрозофилы hsp70 показали, что что hsp70 имели более высокую эффективность в клетках комаров10. Кроме того из-за тепловой ш?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ре Лое Цзянь-Horng институт морской биологии, Национальный университет Тайваня океана для предоставления 3 плазмидные конструкции. Это исследование было поддержано на грант 106-2311-B-197-001 – от министерства науки и технологии (большинство).
Materials
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
References
- Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
- Theilmann, D. A., Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. , 1129-1185 (2005).
- Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H., Shields, V. D. C. Determination of nucleopolyhedrovirus’ taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. , 169-200 (2017).
- Friesen, P. D., Miller, L. K. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. , 141-170 (1997).
- Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
- Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
- Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
- Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
- Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
- Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
- Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
- Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
- . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017)
- Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).
