הביטוי ארעית של גנים זרים בתאי חרקים (sf9) עבור שיטת פונקציונלי
Summary
פרוטוקול זה מתאר חום חלבון הנוצרות על-ידי הלם ביטוי מערכת (pDHsp/V5-שלו/sf9 תא מערכת), אשר יכול לשמש עבור המבטאים חלבונים זרים או הערכת אנטי-אפופטוטיים להיפגע הפעילות של חלבונים זרים פוטנציאליים ו שלהם קטום אמינו חומצות בתאי חרקים.
Abstract
אחת הטכנולוגיות החשובות ביותר לביצוע אנליזה פונקציונלית חלבון במערכת baculovirus במבחנה תא תרבות מערכת ביטוי גנים ארעית. מערכת זו פותחה כדי גנים זרים אקספרס תחת השליטה של האמרגן baculoviral ב ביטוי ארעי פלסמידים. יתר על כן, מערכת זו ניתן להחיל על assay פונקציונלי של baculovirus עצמו או חלבונים זרים. מערכת ביטוי נרחב ביותר מבחינה מסחרית זמינים ג’ין ארעי מפותח בהתבסס על האמרגן מוקדם-מיידי ג’ין (IE) של Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). עם זאת, נצפתה רמה נמוכה ביטוי של גנים זרים בתאי חרקים. לכן, מערכת ביטוי גנים ארעי נבנה לשיפור ביטוי חלבון. במערכת זו, פלסמידים רקומביננטי נבנו כדי להכיל את רצף המטרה תחת השליטה של דרוזופילה חום הלם 70 (Dhsp70) האמרגן. פרוטוקול זה מציג את היישום של זה חום מבוססי הלם pDHsp/V5-שלו (V5 epitope עם היסטידין 6) /זחל כנימה frugiperda נייד מערכת (תא sf9); מערכת זו זמינה רק עבור ביטוי גנים אלא גם להערכת פעילות אנטי-מוות של המועמד חלבונים בתאי חרקים. יתר על כן, מערכת זו יכולים להיות transfected שגם עם פלסמיד רקומביננטי אחד או transfected משותפת לשני פלסמידים רקומביננטי אויבת פוטנציאלית פונקציונלית בתאי חרקים. הפרוטוקול מדגים את היעילות של מערכת זו ומספק במקרה המעשי של טכניקה זו.
Introduction
שתי מערכות ביטוי חלבון נפוץ השתמשו לייצור חלבונים: פרוקריוטים חלבון ביטוי (Escherichia coli ג’ין ביטוי מערכת) ומערכות איקריוטים חלבון הביטוי. מערכת אחת של ביטוי חלבון איקריוטים הפופולרי הוא מערכת (BEVS)1וקטור ביטוי baculovirus. Baculoviruses שימשו כסוכנים הדברה ביולוגית ברחבי העולם החקלאיים ואת יער מזיקים. בעשורים האחרונים, baculoviruses פותחו ככלים ביוטכנולוגי וקטורים ביטוי חלבון גם כן. הגנום של baculoviruses מורכב כפול גדילי DNA מעגלי ומעטפת nucleocapsids2. עד היום, יותר מאשר seventy-eight baculovirus היה מבודד ברצף3. בהתבסס על המפל הטמפורלי של ביטויים ג’ין baculoviral בתאי חרקים המארח, שעתוק הגן ניתן לסווג ארבעה מפלי הזמנית, כולל מיידית מוקדם, מוקדם-נדחתה, מאוחר, מאוחר מאוד גנים4.
BEVSs נקבעו כך היזמים הגן באיחור (כלומר, פאון או p10 יזם) שימשו כדי להסיע את הגנים היעד, בזמן baculovirus רקומביננטי נוצר על ידי רקומבינציה הומולוגית. ביטוי של חלבונים זרים בתאי חרקים על-ידי baculovirus רקומביננטי דומה לזה של חלבונים בתרבית של שינויים post-translational (מתאים לייצור גליקופרוטאין). לפיכך, baculovirus כבר בשימוש נרחב5,6,7. עם זאת, מגבלה אחת היא הנוכחות של מסלולים שונים N-גליקוזילציה ב תאים חרקים7.
לכן, baculovirus ביטוי מערכת חדשה, מערכת ביטוי גנים ארעי, פותחה. מערכת זו מבטא גנים זרים תחת הכונן של היזמים מוקדם-מיידי baculoviral (כלומר-1 יזם) בתאי חרקים. באמצעות מערכת זו, חלבון המטרה ניתן מיד לבטא תחת השליטה של ie-1 יזם תוך שינוי מסלול N-גליקוזילציה בתאי חרקים, וכתוצאה מכך oligosaccharides N-מקושרים יותר7. יתר על כן, הגנים מוקדם-מיידי baculoviral משוקלטים על-ידי התא המארח RNA פולימראז II, אינם דורשים כל גורם ויראלי עבור הפעלה4. לכן, חלבונים זרים יכולים להתבטא בתאי חרקים תוך זמן קצר. עד כה, והחולף מערכת ביטוי גנים הוא אחד הטכנולוגיות החשובות ביותר לביצוע מבחני פונקציונלי חלבון במערכת baculovirus במבחנה תא תרבות. ניתן להחיל את המערכת כדי לנתח את הפונקציה של baculovirus או חלבונים זרים. אחת ממערכות ביטוי גנים ארעי זמינים מסחרית מבוסס על היזמים מוקדם-מיידי ג’ין (IE) של Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2, OpIE1 היזמים).
עם זאת, הרמה הנמוכה ביטוי של גנים זרים בתאי חרקים היה עדיין בעיה כאשר המערכת הביטוי מבוסס-יזם ג’ין ארעי אופי הייתה בשימוש8,9,10. לפיכך, מערכת נוספת של ביטוי גנים ארעי נבנה בהתבסס על האמרגן של דרוזופילה חום הלם חלבון 70 (hsp70) ג’ין8,9. האמרגן של hsp70 עובד ביעילות רבה יותר מאשר יזם baculoviral IE כאשר המושרה על ידי הלם חום בתאי חרקים10. במערכת זו, הגנים היעד שבאו לידי ביטוי תחת הכונן של דרוזופילה הלם חום (Dhsp70) 70 יזם. גנים זרים יכולים להיות בקלות משובטים לתוך פלסמיד ביטוי גנים ארעי על ידי שיטות שיבוט מבוסס ה-PCR. יתר על כן, השליטה של התזמון של ביטוי גנים יכול להתבצע על ידי אינדוקציה הלם חום.
בדו ח זה, אנו בצע את הגישה ולבטא את שלוש truncations שונים של הגן baculoviral (מעכב של אפופטוזיס 3, iap3 מן Lymantria xylina MNPV) באמצעות מערכת ביטוי חלבון ארעי מבוסס-הלם חום, ביטוי חלבונים אלה יחולו על ניתוח פעילות אנטי-מוות. מערכת זו יכול לבטא גם חלבונים זרים במהירות או יותר להחיל על הערכת פעילות אנטי-מוות החלבון בתאים sf9, בעודכם נהנים גם את הפוטנציאל שיוחל מבחני פעילות חלבונים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
המושג חום מבוססי הלם pDHsp/V5-שלו/sf9 תא מערכת תוארה לראשונה על ידי קלם. et al. ב 19948. השוואה של יזם ג’ין baculoviral (IE1) ודרוזופילה hsp70 הראו שכי hsp70 היה יעילות גבוהה יותר של יתוש תאים10. יתר על כן, כתוצאה אינדוקציה הלם חום, העיתוי של ביטוי חלבון יכול להיות נשלט בד?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Leu ג’יאן-Horng ד ר של המכון של ביולוגיה ימית, האוניברסיטה הלאומית טייוואן האוקיינוס על מתן 3 מבנים פלסמיד. מחקר זה נתמך על ידי מענק 106-2311-B-197-001 – משרד המדע, הטכנולוגיה (רובם).
Materials
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
References
- Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
- Theilmann, D. A., Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. , 1129-1185 (2005).
- Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H., Shields, V. D. C. Determination of nucleopolyhedrovirus’ taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. , 169-200 (2017).
- Friesen, P. D., Miller, L. K. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. , 141-170 (1997).
- Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
- Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
- Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
- Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
- Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
- Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
- Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
- Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
- . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017)
- Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).
