Transiente Expression von Fremdgenen in Insekt Zellen (sf9) für funktionelle Protein Assay
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Hitze Schock-induzierte Protein Expressionssystems (pDHsp/V5-His/sf9 Zellsystem), die verwendet werden können, mit dem Ausdruck Fremdeiweiße oder Bewertung der Anti-apoptotische Aktivität des potenziellen Fremdeiweiße und ihre abgeschnittenen amino Säuren in Insektenzellen.
Abstract
Das vorübergehende gen Ausdruck System ist eine der wichtigsten Technologien zur Ausführung von Protein Funktionsanalyse in Baculovirus in Vitro Zellkultursystem. Dieses System wurde entwickelt um ausdrückliche Fremdgene unter die Kontrolle des Baculoviral-Promotors in transiente Expression Plasmiden. Darüber hinaus kann dieses System auf eine funktionelle Assay des Baculovirus selbst oder Fremdeiweiße angewendet werden. Das am weitesten verbreitete und kommerziell verfügbar transiente gen Ausdruck System wird basierend auf der sofortigen-früh gen (IE) Veranstalter von Orgyia Pseudotsugata multicapsid Nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) entwickelt. Jedoch wurde eine Ebene geringe Expression von Fremdgenen in Insektenzellen beobachtet. Daher wurde eine transiente gen Expressionssystems gebaut, für die Verbesserung der Proteinexpression. In diesem System waren rekombinante Plasmide konstruiert, um die Zielsequenz unter der Kontrolle von Drosophila Hitze Schock 70 (Dhsp70) Promoter enthalten. Dieses Protokoll stellt die Anwendung von dieser Hitze Schock-basierte pDHsp/V5-HSI (V5 Epitop mit 6 Histidin) /Spodoptera Frugiperda Zelle (sf9 Zellen) System; Dieses System ist nicht nur für gen-Expression, sondern auch für die Bewertung der Anti-apoptotische Aktivität der Kandidat Proteine in Insektenzellen. Darüber hinaus ist dieses System kann entweder mit einem rekombinante Plasmid transfiziert werden oder Co transfiziert zwei potenziell funktional antagonistischen rekombinante Plasmide in Insektenzellen. Das Protokoll zeigt die Leistungsfähigkeit dieses Systems und bietet einen praktischen Fall diese Technik.
Introduction
Zwei Eiweiß Expressionssysteme werden häufig für die Herstellung von Proteinen: intramolekulare Protein Expressionssysteme (Escherichia coli Gene Expressionssystem) und Eukaryote Expressionssysteme für Protein. Ein beliebtes Eukaryote Protein Ausdruck System ist das Baculovirus Ausdruck Vektor System (BEV)1. Baculoviren dienten zuerst als weltweite biologische Bekämpfungsmittel von Land- und forstwirtschaftliche Schädlinge. In den letzten Jahrzehnten wurden Baculoviren als biotechnologische Werkzeuge für Protein Expressionsvektoren sowie entwickelt. Die Genome von Baculoviren bestehen aus kreisförmigen doppelsträngige DNA und umhüllten Nucleocapsids2. Heute, mehr als 78 Baculovirus wurden Isolate sequenzierten3. Basierend auf den zeitlichen Kaskade von Baculoviral gen Ausdrücke in Wirtszellen Insekt, konnten die Gentranskription in vier zeitliche Kaskaden, einschließlich der sofortigen-früh, verzögert-frühe, späte und sehr späte Gene4eingestuft werden.
BEVSs wurden ausgewiesen, so dass die sehr späten gen Promotoren (d.h., Polyeder oder p10 Promotor) verwendet wurden, um die Zielgene fahren während der rekombinanten Baculovirus durch homologe Rekombination erzeugt wurde. Ausdruck von Fremdproteinen in Insektenzellen durch rekombinante Baculovirus ist ähnlich dem von Säugetieren Proteine in post-translationalen Modifikationen (geeignet für Glykoprotein Produktion). So wurde das Baculovirus verbreitete5,6,7. Eine Einschränkung ist jedoch das Vorhandensein von verschiedenen N-Glykosylierung Wege in Insektenzellen7.
Daher wurde eine neue Baculovirus Expressionssystems Expressionssystems transiente gen entwickelt. Dieses System drückt Fremdgene unter dem Laufwerk Baculoviral unmittelbaren frühen Förderer (dh-1 -Promotor) in Insektenzellen. Durch den Einsatz dieses Systems kann das Zielprotein sofort unter die Kontrolle des dh-1 Promotors ausgedrückt werden, während des Änderns des N-Glykosylierung Weges in Insektenzellen, wodurch bessere N-linked Oligosaccharide7. Darüber hinaus Baculoviral unmittelbaren frühen Gene sind von der Wirtszelle RNA-Polymerase II transkribiert und erfordern keine virale Faktoren für Aktivierung4. Daher können Fremdeiweiße in Insektenzellen innerhalb kurzer Zeit ausgedrückt werden. Bis heute ist die transiente ist gen Expressionssystems eine der wichtigsten Technologien zur Ausführung von Protein funktionelle Assays in Baculovirus in Vitro Zellkultursystem. Das System kann angewendet werden, um die Funktion des Baculovirus oder Fremdeiweiße zu analysieren. Eines der im Handel erhältlichen transiente gen Ausdruck Systeme basiert auf die unmittelbaren frühen gen (IE) Förderer von Orgyia Pseudotsugata multicapsid Nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 und OpIE1 Promotoren).
Im Untergeschoss der Expression von Fremdgenen in Insektenzellen war jedoch noch ein Problem, als Promotor-basierte transiente gen Expressionssystems OpIE verwendeten8,9,10war. So wurde ein anderes Transienten gen Ausdruck System basierend auf der Projektträger der Drosophila Hitze Shock Protein 70 (hsp70) gen8,9erstellt. Die Förderer der hsp70 arbeitet effizienter als Baculoviral IE Promotor, wenn durch einen Hitzeschock in Insektenzellen10. In diesem System wurden die Zielgene unter dem Laufwerk von Drosophila Hitze Schock 70 (Dhsp70) Promoter geäußert. Fremdgene können leicht in die transiente gen Ausdruck Plasmid von PCR-basierten Klonen Methoden geklont werden. Darüber hinaus kann die Kontrolle des Zeitpunkts für die Genexpression durch Hitze Schock Induktion durchgeführt werden.
In diesem Bericht, wir folgen dem Ansatz und drei verschiedenen Trunkierungen des Baculoviral-Gens (Inhibitor der Apoptose 3, iap3 von Lymantria Xylina MNPV) mittels Hitze Schock-basierte transiente Protein Expressionssystems und weiter gelten Sie diese exprimierten Proteine auf Anti-apoptotische Aktivitätsanalyse. Dieses System kann entweder schnell Fremdeiweiße ausdrücken oder zur Bewertung der Anti-apoptotische Proteinaktivität in sf9 Zellen, wobei er auch das Potenzial für andere Protein Aktivität Assays gelten weiter angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Konzept der Hitze Schock-basierte pDHsp/V5-His/sf9 Zellsystem wurde erstmals von Clem Et Al. 19948beschrieben. Vergleich der Baculoviral gen Promotor (IE1) und Drosophila hsp70 zeigte, dass hsp70 hatte eine höhere Effizienz in Mücke Zellen10. Darüber hinaus konnte das Timing der Proteinexpression aufgrund der Hitze-Schock-Induktion, genau nach Hitze-Schock-Behandlung kontrolliert werden. Dieses System galt dann für Protein funktio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Jian-Horng Leu des Institute of Marine Biology, National Taiwan Ocean University für die Bereitstellung von 3 Plasmid-Konstruktionen. Diese Forschung wurde von Grant 106-2311-B-197-001 – aus dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST) unterstützt.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
References
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