Geçici ifade, yabancı genlerin Protein fonksiyonel tahlil için böcek hücrelerindeki (sf9)
Summary
Yabancı proteinler ifade veya anti-apoptotik etkinliğini potansiyel yabancı proteinler ve onların kesilmiş amino değerlendirmek için kullanılabilir bir ısı şok kaynaklı protein ifade sistemi (pDHsp/V5-O’nun/sf9 hücre), bu iletişim kuralını açıklar asitler böcek hücrelerinde.
Abstract
Geçici gen ifade sistem baculovirus vitro hücre kültür sistemi içinde protein fonksiyonel analiz gerçekleştirmek için en önemli teknolojileri biridir. Bu sistem geçici ifade plazmid baculoviral düzenleyicinin kontrolü altında ifade yabancı genleri için geliştirilmiştir. Ayrıca, bu sistemin fonksiyonel testin kendisi baculovirus veya yabancı proteinler için uygulanabilir. En yaygın ve ticari olarak kullanılabilir geçici gen ifade sistem Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) erken hemen gen (IE) organizatörü göre geliştirilmiştir. Ancak, düşük ifade düzey böcek hücreleri yabancı genlerin gözlendi. Bu nedenle, bir geçici gen ifade sistemi protein ifade artırmak için inşa edilmiştir. Bu sistemde, rekombinant plazmid Drosophila ısı şok 70 (Dhsp70) düzenleyicinin kontrolü altında hedef sıra içerecek şekilde inşa edilmiş. Bu iletişim kuralı bu ısı şok tabanlı pDHsp/V5-O’nun (V5 epitop 6 histidin ile) uygulanması sunar /Spodoptera frugiperda hücre (sf9 hücre) sistemi; Bu sistem sadece gen ekspresyonu böcek hücrelerinde aday proteinlerin anti-apoptotik etkinliğini değerlendirmek için de kullanılabilir. Ayrıca, bu sistem de bir rekombinant plazmid ile transfected ya da iki potansiyel olarak işlevsel antagonistik rekombinant plazmid böcek hücrelerinde ortak transfected. Protokol bu sistemin verimliliği gösterir ve bu teknik pratik olgusu sağlar.
Introduction
İki protein ifade sistemleri yaygın olarak kullanılan proteinler üretmek için: prokaryotlar protein ifade sistemleri (Escherichia coli gen ifade sistemi) ve ökaryot protein ifade sistemleri. Bir popüler ökaryot protein ifade baculovirus ifade vektör sistemi (BEVS)1sistemidir. Baculoviruses ilk dünya çapında biyolojik mücadele etmeni tarım kullanılmıştır ve orman zararlıları. Son birkaç on yıl içinde baculoviruses için protein ifade vektörel çizimler de Biyoteknolojik araçları olarak geliştirilmiştir. Baculoviruses genleri çift iplikçikli dairesel DNA ve saran nucleocapsids2oluşur. , Yetmiş sekiz baculovirus bugüne kadar fazla yalıtır sıralı3olmuştur. Baculoviral gen ifadeleri ana böcek hücrelerinde zamansal çağlayan dayanarak, gen transkripsiyonu gecikme-erken, geç ve çok geç genler4erken acil-dahil olmak üzere dört zamansal cascades sınıflandırılır olabilir.
Böylece çok geç gen rehberleri (Yani, polihedron veya p10 organizatörü) rekombinant baculovirus homolog rekombinasyon tarafından oluşturulan iken hedef genlerin sürücü için kullanılan BEVSs belirlenmiş. İfade içinde böcek hücreleri rekombinant baculovirus tarafından yabancı proteinlerin translasyonel modifikasyonlar (glikoprotein üretimi için uygun) memeli proteinlerin benzer. Böylece, baculovirus yaygın olarak kullanılan5,6,7oldu. Ancak, bir sınırlama böcek hücreleri7farklı N-glikozilasyon yolları varlığıdır.
Bu nedenle, yeni bir baculovirus ifade sistem geçici gen ifade sistem geliştirilmiştir. Bu sistem baculoviral erken hemen rehberleri (yani-1 organizatörü) böcek hücrelerinde sürücü altında yabancı genlerin ifade eder. Bu sistemi kullanarak, hedef protein hemen yani-1 düzenleyicinin kontrolü altında daha iyi N bağlı oligosakkaritler7‘ kaynaklanan N-glikozilasyon yolu böcek hücrelerinde değiştirirken ifade edilebilir. Ayrıca, baculoviral erken hemen genler konak hücre RNA polimeraz II tarafından transkripsiyonu ve viral herhangi bir faktör harekete geçirmek4için gerek yoktur. Bu nedenle, yabancı proteinler kısa bir süre içinde böcek hücrelerinde ifade edilebilir. Bugüne kadar geçici gen ifade sistem baculovirus vitro hücre kültür sistemi içinde protein işlevsel testleri gerçekleştirmek için kullanılan en önemli teknolojileri biridir. Sistem işlevi ya baculovirus ya da yabancı proteinler, analiz etmek için uygulanır. Piyasada bulunan geçici gen ifade sistemlerinden birini Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 ve OpIE1 rehberleri) erken hemen gen (IE) Organizatör üzerinde temel alır.
Ancak, OpIE organizatörü tabanlı geçici gen ifade sistemi kullanılan8,9,10yaşındayken alt ifade düzeyinde böcek hücreleri yabancı genlerin hala bir sorun oldu. Böylece, başka bir geçici gen ifade sistem Drosophila ısı şok protein 70 (hsp70) gen8,9organizatörü dayalı inşa edilmiştir. Hsp70 organizatörü baculoviral IE organizatörü böcek hücreleri10şokta ısı çarpması çok daha etkili biçimde çalışır. Bu sistemde, Drosophila ısı şok 70 (Dhsp70) organizatörü sürücü altında hedef genlerin ifade edildi. Yabancı genlerin kolayca PCR tabanlı klonlama yöntemlerle geçici gen ifade plazmid kopyalanmış. Ayrıca, gen ekspresyonu için zamanlama kontrolünü ısı şok indüksiyon tarafından gerçekleştirilebilir.
Bu rapordaki yaklaşımı izleyin ve baculoviral gen (apoptosis 3 inhibitörü, Lymantria xylina MNPV dan iap3 ) üç farklı truncations ısı şok tabanlı geçici protein ifade sistemi kullanarak hızlı ve daha fazla ifade bu proteinler anti-apoptotik etkinlik analizi üzerinde uygulamak. Bu sistem de yabancı proteinler hızlı bir şekilde ifade edebilir ya da daha fazla protein anti-apoptotik faaliyet sf9 hücrelerdeki değerlendirilmesi de diğer protein etkinlik deneyleri için uygulanacak potansiyele sahip iken uygulanması.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isı şok tabanlı pDHsp/V5-O’nun/sf9 hücre sistemi kavramı ilk Clem ve ark. 19948tarafından tanımlanmıştır. Drosophila hsp70 baculoviral gen Düzenleyici (IE1) ile karşılaştırması gösterdi o hsp70 daha yüksek bir verim sivrisinek hücreleri10dakika sonra vardı. Ayrıca, ısı şok indüksiyon nedeniyle protein ifade zamanlama tam olarak ısı şok tedavi sonrası kontrol. Bu sistem o zaman protein için karides ve nucleopo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Jian-Horng Leu, Enstitüsü deniz biyoloji, Ulusal Tayvan Üniversitesi okyanus 3 plazmid yapılar sağlamak için teşekkür ederiz. Bu araştırma tarafından Grant 106-2311-B-197-001 – Bakanlığı bilim ve Teknoloji (en) destek verdi.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
References
- Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
- Theilmann, D. A., Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. , 1129-1185 (2005).
- Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H., Shields, V. D. C. Determination of nucleopolyhedrovirus’ taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. , 169-200 (2017).
- Friesen, P. D., Miller, L. K. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. , 141-170 (1997).
- Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
- Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
- Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
- Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
- Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
- Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
- Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
- Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
- . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017)
- Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).
