مقايسة بسيطة ومنخفضة التكلفة لقياس أمبوليشن في نماذج الماوس من ضمور العضلات
Summary
ويصف هذا البروتوكول نظام مرن، ومنخفضة التكلفة لقياس أمبوليشن الفأرة في مقايسة نشاط حقل مفتوح. نظهر أن مقايسة أمبولاتيون 6 دقائق استناداً إلى هذا النظام يكشف عن انخفاض في الحركة الطوعية في الفئران mdx ، ويميز بدقة التحسين في إنقاذ الخاصة بالعضلات لهذه الحيوانات.
Abstract
قياس النتائج الفنية في علاج ضمور العضلات جانبا أساسيا من التجارب الإكلينيكية. تقييم أمبوليشن الطوعية في نماذج الماوس هو مقايسة نشاط غير الغازية واستنساخه يماثل مباشرة تدابير أمبوليشن المريض مثل الاختبار 6 دقائق سيرا على الأقدام، والمتعلقة بتنقل عشرات. العديد من الأساليب الشائعة لاختبار سرعة أمبوليشن الماوس والمسافة تستند إلى اختبار حقل مفتوح، حيث يتم قياس حرية الحركة الحيوان داخل ساحة على مر الزمن. واحد الجانب السلبي الرئيسي لهذا النهج هو أن البرمجيات التجارية والمعدات اللازمة لتتبع الحركة ذات الدقة العالية مكلفة وقد يتطلب نقل الفئران إلى مرافق متخصصة للاختبار. وهنا يصف لنا نظام منخفضة التكلفة، والقائم على الفيديو لقياس أمبوليشن الماوس التي تستخدم البرمجيات الحرة والمفتوحة المصدر. باستخدام هذا البروتوكول، علينا أن نظهر أن أمبوليشن الطوعية في طراز الماوس ديستروفين خالية null mdx لضمور العضلات دوشين (DMD) انخفض بالنسبة إلى نشاط الماوس البرية من نوع. في mdx الفئران معربا عن التحوير أوتروفين، لا تراعي هذه العجوزات النشاط والمسافة الإجمالية سافر لا يمكن تمييزها من الفئران البرية من نوع. هذه الطريقة فعالة لقياس التغيرات في أمبولاتيون الطوعية المرتبطة بأمراض تندب، ويوفر منصة متعددة الاستخدامات التي يمكن تكييفها مع سهولة إلى إعدادات البحث المتنوعة.
Introduction
قياسات موثوقة واستنساخه لوظيفة العضلات ضرورية لتقييم مدى فعالية العلاجات المحتملة لإعلان الدوحة الوزاري. DMD اضطراب وراثي الناتجة عن الطفرات في الجينات ديستروفين، مما يؤدي إلى ضعف العضلات التدريجي، فقد أمبوليشن، والفشل في نهاية المطاف القلبية. نموذج الحيوان الأكثر استخداماً من إعلان الدوحة الوزاري هو الماوس ديستروفين خالية null mdx . بطارية اختبارات الوظيفية ظهرت فحوصات روتينية لتقييم تطور المرض في الماوس mdx كذلك كما في نماذج حيوانية مماثلة أخرى ضمور وميوباثيس. استخداماً في فيفو فحوصات تشمل قياس قوة قبضة فوريليمب، أسلاك معلقة الوقت، روتارود كحد أقصى، والوقت لاستنفاد أثناء نشاط قيد التشغيل، والسيارات المطحنة تتبع. كان هناك جهد كبير في الميدان من أجل توحيد هذه الاختبارات، بهدف الحد من تقلب بين الدراسات الإكلينيكية وزيادة إمكانات متعدية للمداواة اختبارها في الفئران1،2.
فئة هامة من التجارب الإكلينيكية هو قياس حركة طوعية، ومعلمة التي كثيرا ما يتم تغيير في نماذج موريني من ضمور العضلات. هذا عادة ما يتم اختباره من خلال فحوصات استناداً إلى رصد النشاط حقل مفتوح، وقد تقييم أفقي (المشي) أو الحركات الرأسية (تربية) خلال دقائق أو ساعات2،،من34. عدد من الدراسات أظهرت الحركة الطوعية تغيير في الفئران mdx ، لا سيما بعد التمرين، وأظهرت هذه القياسات لتكون حساسة لتطور المرض وعلاج المخدرات. القيد الرئيسي واحد في أداء هذه الاختبارات هو الحاجة إلى المعدات المتخصصة، وعالية التكلفة. ويرد هنا، وسيلة منخفضة التكلفة التي تتعقب أمبوليشن الماوس باستخدام الموارد المتاحة بسهولة.
مسافة 6 دقائق سيرا على الأقدام من متري تستخدم عادة كأداة لتقييم السريري في الأفراد مع دوشين ضمور العضلات5،6. وقد استخدمت التعديلات من هذا الإجراء لتقييم النتائج في نماذج حيوانية دوشين، بما في ذلك الفئران mdx 7 والذهبي المسترد الكلاب ضمور العضلات (جرمد)8. في هذه الدراسة، نقوم بتسجيل الحركة الطوعية فتح الحقل في 6 دقائق فور تحديا ممارسة خفيفة. وحسبت المسافة أمبوليشن ثم استخدام البرمجيات الحرة المفتوحة المصدر لقياس الحركة الأفقية على مر الزمن.
والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب أن الحيوانات يمكن اختبارها في مجموعة متنوعة من الإعدادات دون الحاجة إلى معدات متخصصة أو البرمجيات التجارية ذات التكلفة العالية للتحليل. أحد الجوانب الهامة لهذا التحليل أنه يمكن أن يتم في أجواء مختبرية أساسية دون الحاجة إلى الانتقال أو نقل الفئران من فيفاريوم إلى منشأة أساسية متخصصة. البروتوكول فيديو-تتبع الموصوف هنا هو مناسبة تماما لتقييم أمبولاتيون على مدى فترات زمنية قصيرة نسبيا ويمكن الكشف عن نشاط الاختلافات بين الفئران البرية من نوع و mdx ،، فضلا عن تكشف عن تحسن الوظيفية في عملية إنقاذ نموذج من إعلان الدوحة الوزاري.
Protocol
Representative Results
Discussion
مقايسة حقل مفتوح يوفر طريقة فعالة وغير الغازية لاختبار وظيفة الحركة في نماذج الماوس من أمراض العضلات، والاختلافات في هذا التحليل بمثابة تدبير قيمة نقطة نهاية للدراسات ما قبل السريرية. حد كبير واحد مع هذا النوع من التحليل هو إمكانية عالية التكلفة ومحدودية الحصول على نشاط نظم الرصد. في هذه …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة [R01 AR048179 و R01 HL126204 R.C.W، T32 AR059033 و F32 AR069469to E.M.G] وضمور العضلات رابطة الولايات المتحدة الأمريكية [274143 و 416364 إلى R.C.W.].
Materials
| Video camera | Apple Inc. | ME553LL/A | For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent) |
| Kinovea software (version 0.8.15) | Kinovea Association | Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org) | |
| iMovie (version 10.0.6) | Apple Inc. | Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional) | |
| Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber) | Rubbermaid | # 1778013 | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. |
| Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber) | US Acrylic, LLC | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. | |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | Male 6 month mice |
| C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | Male 6 month mice |
| mdx: utrophin-Tg (fiona) | Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies | Male 6 month mice |
References
- Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2. 2, (2010).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785 (2014).
- Kobayashi, Y. M., et al. Sarcolemma-localized nNOS is required to maintain activity after mild exercise. Nature. 456 (7221), 511-515 (2008).
- Belanto, J. J., et al. Microtubule binding distinguishes dystrophin from utrophin. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5723-5728 (2014).
- McDonald, C. M., et al. The 6-minute walk test in Duchenne/Becker muscular dystrophy: longitudinal observations. Muscle Nerve. 42 (6), 966-974 (2010).
- Mazzone, E., et al. Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 20 (11), 712-716 (2010).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
- Acosta, A. R., et al. Use of the six-minute walk test to characterize golden retriever muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 26 (12), 865-872 (2016).
- Sousa, N., Almeida, O. F., Wotjak, C. T. A hitchhiker’s guide to behavioral analysis in laboratory rodents. Genes Brain Behav. 5, 5-24 (2006).
- Gibbs, E. M., et al. High levels of sarcospan are well tolerated and act as a sarcolemmal stabilizer to address skeletal muscle and pulmonary dysfunction in DMD. Hum Mol Genet. 25 (24), 5395-5406 (2016).
- Gillis, J. M. Multivariate evaluation of the functional recovery obtained by the overexpression of utrophin in skeletal muscles of the mdx mouse. Neuromuscul Disord. 12, S90-S94 (2002).
- Tinsley, J., et al. Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med. 4 (12), 1441-1444 (1998).
- Song, Y., et al. Suite of clinically relevant functional assays to address therapeutic efficacy and disease mechanism in the dystrophic mdx mouse. J Appl Physiol. 122 (3), 593-602 (2017).
- Bolivar, V. J. Intrasession and intersession habituation in mice: from inbred strain variability to linkage analysis. Neurobiol Learn Mem. 92 (2), 206-214 (2009).
