Un análisis Simple y de bajo costo para la medición de actividad en modelos de ratón de la Distrofia Muscular
Summary
Este protocolo describe un sistema flexible y de bajo costo para la medición de ambulación de ratón en un ensayo de actividad de campo abierto. Mostramos que un paseo de 6 minutos el análisis basado en este sistema detecta una disminución del movimiento voluntario en ratones mdx y distingue con precisión mejora en un rescate de músculo-específica de estos animales.
Abstract
Medición de los resultados funcionales en el tratamiento de la distrofia muscular es un aspecto esencial de la prueba preclínica. La evaluación de la actividad voluntaria en modelos de ratón es un ensayo de actividad no invasiva y reproducible que es directamente análoga a las medidas del paciente deambulación como la prueba de caminata de 6 minutos y relacionados con partituras de movilidad. Muchos métodos comunes para las pruebas de velocidad de deambulación de ratón y la distancia se basan en la prueba de campo abierto, donde la libre circulación de los animales dentro de una arena se mide con el tiempo. Una desventaja importante de este enfoque es que el software comercial y equipo para el seguimiento de movimiento de alta resolución es caro y requiera transferencia de ratones a instalaciones especializadas para la prueba. Aquí, describimos un sistema de bajo costo, basado en video para medir la ambulación de ratón que utiliza software libre y código abierto. Mediante este protocolo, demostramos eso deambulación voluntaria en el modelo de ratón mdx de la distrofina es nulo por distrofia muscular de Duchenne (DMD) está disminuida en relación con la actividad de tipo ratón. En mdx ratones expresan el transgén utrophin, estos déficits de actividad no se observan y la distancia total recorrida es indistinguible de los ratones de tipo salvaje. Este método es eficaz para medir cambios en deambulación voluntaria asociada a patología distrófica y proporciona una plataforma versátil que puede adaptarse fácilmente a la configuración de diversas investigaciones.
Introduction
Mediciones fiables y reproducibles de la función muscular son fundamentales para evaluar la eficacia de las terapias potenciales para DMD. DMD es un trastorno genético causado por mutaciones en el gene del dystrophin, conduce a una debilidad muscular progresiva, pérdida de la ambulación y eventual insuficiencia cardiorrespiratoria. El modelo animal más ampliamente utilizado de la DMD es el ratón mdx de la distrofina es nulo. Una batería de pruebas funcionales han surgido como ensayos de rutina para evaluar la progresión de la enfermedad en el ratón mdx así como en modelos animales similares de otras distrofias y miopatías. Comúnmente usado en vivo ensayos incluyen mediciones de fuerza de agarre del forelimb, alambre colgante tiempo, máximo de rotarod, hasta la extenuación durante la actividad de ejecución y el motor de caminadora seguimiento. Ha habido un esfuerzo sustancial en el campo para estandarizar las pruebas, con el objetivo de reducir la variabilidad entre estudios preclínicos y aumentando las posibilidades de traslación de la terapéutica probada en ratones de1,2.
Una categoría importante de ensayos preclínicos es la medida del movimiento voluntario, un parámetro que se altera con frecuencia en modelos murinos de la distrofia muscular. Esto generalmente es probada por ensayos basados en el monitoreo de actividades de campo abierto y puede evaluar horizontal (a pie) o movimientos verticales (cría) en un transcurso de minutos u horas2,3,4. Varios estudios han demostrado movimiento voluntario a modificarse en ratones mdx , especialmente después del ejercicio, y estas medidas han demostrado ser sensibles a la progresión de enfermedad y tratamiento de drogas. Una limitación importante en la realización de estos ensayos es la necesidad de equipos especializados, de alto costo. Aquí, se presenta un método de bajo costo que paseo de ratón utilizando los recursos disponibles.
La distancia de caminata de 6 minutos es una medida comúnmente utilizada como una herramienta de evaluación clínica en los individuos con distrofia muscular de Duchenne5,6. Modificaciones de esta medida se han utilizado para evaluar los resultados en modelos animales de Duchenne, de ratones mdx 7 como la distrofia muscular (GRMD) de golden retriever perros8. En este estudio, se registra movimiento voluntario campo abierto en 6 minutos inmediatamente después de un reto de ejercicio suave. Distancia de deambulación entonces se calculó utilizando software libre de código abierto para medir movimiento horizontal en el tiempo.
La principal ventaja de este método es que animales pueden probarse en una variedad de ajustes sin necesidad de equipo especializado o alto costo comercial del software para el análisis. Un aspecto importante de este análisis es que puede realizarse en un entorno de laboratorio básicos sin necesidad de mover o transferir ratones de vivero a una instalación base especializado. El protocolo de seguimiento de video descrito aquí es muy adecuado para la evaluación de la deambulación durante períodos relativamente cortos puede detectar diferencias de actividad entre ratones de tipo salvaje y mdx , como revelan mejoría funcional en un rescate modelo de DMD.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo de campo abierto proporciona una manera eficaz y no invasivo para probar la función de motor en modelos de ratón de la enfermedad del músculo, y las variaciones de este ensayo pueden servir como una medida de extremo valor para los estudios preclínicos. Una limitación importante con este tipo de análisis es la accesibilidad limitada y alto costo de los sistemas de monitoreo de actividad. En este estudio, se demuestra un sistema de bajo costo para el análisis de la actividad de campo abierto que pueden ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los institutos nacionales de salud [AR048179 R01 y R01 HL126204 R.C.W, AR059033 T32 y F32 AR069469to E.M.G] y los E.e.u.u. de la Asociación de la Distrofia Muscular [274143 y 416364 a casos].
Materials
| Video camera | Apple Inc. | ME553LL/A | For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent) |
| Kinovea software (version 0.8.15) | Kinovea Association | Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org) | |
| iMovie (version 10.0.6) | Apple Inc. | Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional) | |
| Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber) | Rubbermaid | # 1778013 | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. |
| Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber) | US Acrylic, LLC | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. | |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | Male 6 month mice |
| C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | Male 6 month mice |
| mdx: utrophin-Tg (fiona) | Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies | Male 6 month mice |
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