Un test Simple et peu coûteuse pour mesurer la déambulation dans des modèles murins de la dystrophie musculaire
Summary
Ce protocole décrit un système flexible et peu onéreuse pour mesurer ambulation de souris en un dosage de l’activité de plein champ. Nous montrons qu’un test de marche de 6 minutes basé sur ce système détecte une diminution des mouvements volontaires chez la souris mdx et distingue précisément amélioration à un sauvetage d’un muscle spécifique de ces animaux.
Abstract
Mesurer les résultats fonctionnels dans le traitement de la dystrophie musculaire est un aspect essentiel des essais précliniques. L’évaluation de l’ambulation volontaire dans des modèles murins est un test non invasif et reproductible de l’activité qui est directement analogues aux mesures du patiente ambulation tel que le test de marche de 6 minutes et scores de mobilité. Beaucoup de méthodes communes pour tester la souris ambulation vitesse et la distance sont basées sur le test de plein champ, où la libre circulation de l’animal dans une arène est mesurée au fil du temps. Un inconvénient majeur de cette approche est que les logiciels commerciaux et équipements pour le suivi de mouvement haute résolution est coûteux et peut nécessiter le transfert de souris à des établissements spécialisés pour les tests. Nous décrivons ici un système peu coûteux et axée sur la vidéo pour mesurer ambulation de souris qui utilise des logiciels libres et open source. Utilisant ce protocole, nous démontrons qu’ambulation volontaire dans le modèle de souris mdx de la dystrophine null pour la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est diminuée par rapport à l’activité souris sauvage. Dans mdx , souris exprimant le transgène utrophine, ces déficits d’activité ne sont pas respectées et la distance totale parcourue est indiscernable de la souris de type sauvage. Cette méthode est efficace pour mesurer les variations ambulation volontaire associé à une pathologie dystrophique et fournit une plate-forme polyvalente qui peut être facilement adaptée aux paramètres de recherche diversifié.
Introduction
Des mesures fiables et reproductibles des fonctions musculaires sont essentiels pour évaluer l’efficacité des thérapies potentielles de DMD. DMD est un trouble génétique causé par des mutations dans le gène de la dystrophine, conduisant à une faiblesse musculaire progressive, perte de déambulation et éventuelle insuffisance cardiorespiratoire. Le modèle animal plus largement utilisé de DMD est la souris mdx de la dystrophine null. Une batterie de tests fonctionnels sont apparus comme des tests de routine pour évaluer la progression de la maladie chez la souris mdx , ainsi que dans des modèles animaux similaires d’autres dystrophies musculaires et myopathies. Couramment utilisés en vivo essais comprennent des mesures de la force de préhension des membres antérieurs, fil pour accrocher des temps, rotarod maximum, temps d’épuisement au cours du suivi d’activité en cours d’exécution et moteur tapis roulant. Il y a eu un effort considérable dans le domaine de normaliser ces tests, dans le but de réduire la variabilité entre les études précliniques et accroître le potentiel translationnel des agents thérapeutiques testés dans la souris1,2.
Un volet important des essais précliniques est la mesure des mouvements volontaires, un paramètre qui est fréquemment altéré dans les modèles murins de la dystrophie musculaire. Ceci est généralement testé par des études basées sur le contrôle de l’activité de plein champ et peut évaluer horizontal (à pied) ou des mouvements verticaux (élevage) sur un parcours de quelques minutes ou heures2,3,4. Un certain nombre d’études ont montré des mouvements volontaires pour être modifiée chez les souris mdx , notamment après l’exercice, et ces mesures ont démontré d’être sensible à la progression de la maladie et de traitement drogue. Une des limites principales dans l’exécution de ces tests est le besoin d’équipement spécialisé et coûteux. Ici, une méthode peu coûteux qui suit ambulation de souris à l’aide des ressources disponibles est présentée.
La distance de marche de 6 minutes est une mesure couramment utilisée comme un outil d’évaluation clinique chez les personnes atteintes de la dystrophie musculaire de Duchenne5,6. Modifications de cette mesure ont été utilisées pour évaluer les résultats dans des modèles animaux de Duchenne, y compris de souris mdx 7 et de chiens golden retriever de Duchenne (GRMD)8. Dans cette étude, nous enregistrons le mouvement volontaire de plein champ dans les 6 minutes immédiatement après une faute d’exercice doux. Distance de marche a ensuite été calculé à l’aide de logiciel open source libre pour mesurer le mouvement horizontal au fil du temps.
Le principal avantage de cette méthode est que les animaux peut être testés dans une variété de configurations sans avoir besoin d’équipement spécialisé ou coût élevé des logiciels commerciaux pour l’analyse. Un aspect important de cette analyse est qu’elle peut être réalisée dans un environnement de laboratoire de base sans avoir besoin de déplacer ou de transférer la souris hors du vivarium à un laboratoire spécialisé central. Le protocole de suivi vidéo décrit ici est bien adapté à l’évaluation de déambulation au cours de périodes relativement peu de temps et peut détecter des différences d’activité entre souris sauvage et mdx , ainsi que révèlent une amélioration fonctionnelle dans une opération de sauvetage modèle de DMD.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’essai de champ libre offre un moyen efficace et non invasif pour tester la fonction motrice chez les modèles murins de la maladie du muscle, et les variations de ce test peuvent servir en guise de point de terminaison précieuse pour des études précliniques. Une limitation majeure avec ce type de test est l’accessibilité limitée et de desserte à coût élevé de l’activité des systèmes de surveillance. Dans cette étude, nous montrons un système peu coûteux pour l’analyse d’activités de plein champ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Institutes of Health [R01 AR048179 et R01 HL126204 R.C.W, AR059033 T32 et F32 AR069469to E.M.G] et la Muscular Dystrophy Association USA [274143 et 416364 à R.C.W.].
Materials
| Video camera | Apple Inc. | ME553LL/A | For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent) |
| Kinovea software (version 0.8.15) | Kinovea Association | Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org) | |
| iMovie (version 10.0.6) | Apple Inc. | Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional) | |
| Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber) | Rubbermaid | # 1778013 | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. |
| Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber) | US Acrylic, LLC | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. | |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | Male 6 month mice |
| C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | Male 6 month mice |
| mdx: utrophin-Tg (fiona) | Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies | Male 6 month mice |
References
- Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2. 2, (2010).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785 (2014).
- Kobayashi, Y. M., et al. Sarcolemma-localized nNOS is required to maintain activity after mild exercise. Nature. 456 (7221), 511-515 (2008).
- Belanto, J. J., et al. Microtubule binding distinguishes dystrophin from utrophin. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5723-5728 (2014).
- McDonald, C. M., et al. The 6-minute walk test in Duchenne/Becker muscular dystrophy: longitudinal observations. Muscle Nerve. 42 (6), 966-974 (2010).
- Mazzone, E., et al. Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 20 (11), 712-716 (2010).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
- Acosta, A. R., et al. Use of the six-minute walk test to characterize golden retriever muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 26 (12), 865-872 (2016).
- Sousa, N., Almeida, O. F., Wotjak, C. T. A hitchhiker’s guide to behavioral analysis in laboratory rodents. Genes Brain Behav. 5, 5-24 (2006).
- Gibbs, E. M., et al. High levels of sarcospan are well tolerated and act as a sarcolemmal stabilizer to address skeletal muscle and pulmonary dysfunction in DMD. Hum Mol Genet. 25 (24), 5395-5406 (2016).
- Gillis, J. M. Multivariate evaluation of the functional recovery obtained by the overexpression of utrophin in skeletal muscles of the mdx mouse. Neuromuscul Disord. 12, S90-S94 (2002).
- Tinsley, J., et al. Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med. 4 (12), 1441-1444 (1998).
- Song, Y., et al. Suite of clinically relevant functional assays to address therapeutic efficacy and disease mechanism in the dystrophic mdx mouse. J Appl Physiol. 122 (3), 593-602 (2017).
- Bolivar, V. J. Intrasession and intersession habituation in mice: from inbred strain variability to linkage analysis. Neurobiol Learn Mem. 92 (2), 206-214 (2009).
