Det här protokollet beskriver en flexibel, låg kostnad system för att mäta mus förflyttningar i en öppna fältet aktivitet assay. Vi visar att en 6-minuters förflyttningar analys utifrån detta system upptäcker en minskning av frivillig rörelse i mdx möss och exakt skiljer förbättring i en muskel-specifika räddning av dessa djur.
Mäta funktionella resultat vid behandling av muskeldystrofi är en viktig aspekt av prekliniska tester. Bedömningen av frivilliga förflyttningar i musmodeller är en icke-invasiv och reproducerbara verksamhet som är direkt jämförbar med åtgärder av patientens mobilitet såsom 6-minuters gångtest och relaterade rörlighet noter. Många vanliga metoder för att testa musen förflyttningar hastighet och avstånd är baserade på öppna fältet testet, där djurets fria rörlighet inom en arena mäts över tid. En stor nackdel med detta tillvägagångssätt är att kommersiell programvara och utrustning för högupplösta motion tracking är dyrt och kanske kräver överföring av möss till specialiserade anläggningar för testning. Här beskriver vi en låg kostnad, video-baserade system för att mäta mus förflyttningar som använder fri och öppen programvara. Användning av detta protokoll, visar vi att frivilliga förflyttningar i dystrofin-null mdx musmodell för Duchennes muskeldystrofi (DMD) minskas i förhållande till vildtyp mus aktivitet. I mdx möss att uttrycka den utrophin transgenens, dessa aktivitet underskott iakttas inte och den totala tillryggalagda är omöjlig att skilja från vildtyp möss. Denna metod är effektiv för att mäta förändringar i frivilliga förflyttningar är associerad med dystrofa patologi, och ger en mångsidig plattform som kan anpassas lätt till olika forskning inställningar.
Tillförlitliga och reproducerbara mätningar av muskelfunktion är kritiska för att utvärdera effekten av potentiella behandlingar för DMD. DMD är en genetisk sjukdom som orsakas av mutationer i dystrofingenen, leder till Progressiv muskelsvaghet, förlust av förflyttningar och eventuellt kardiorespiratorisk fel. Den mest använda djurmodell av DMD är dystrofin-null mdx musen. Ett batteri av funktionella tester har dykt upp som rutinmässiga analyser för att utvärdera sjukdomsprogression i mdx musen samt som i liknande djurmodeller av andra dystrofier och myopatier. Vanligen används i vivo analyser omfatta mätningar av forelimb greppstyrka, tråd hängande tid, rotarod maximalt, tid till utmattning under löpbandet körs, och motoriska aktivitetsspårning. Det har varit en betydande insats i fältet att standardisera dessa tester, med målet att minska variabiliteten mellan prekliniska studier och öka translationell potential therapeutics testas i möss1,2.
En viktig kategori av prekliniska tester är mätning av frivillig rörelse, en parameter som ofta ändras i murina modeller av muskeldystrofi. Detta är vanligtvis testad av analyser baserat på öppna fältet aktivitetsövervakning och kan utvärdera antingen vågrät (gångavstånd) eller vertikala (uppfödning) rörelser över en kurs i minuter eller timmar2,3,4. Ett antal studier har visat frivillig rörelse ändras i mdx mice, särskilt efter träning, och dessa mätningar har visat sig vara känsliga för läkemedel behandling och sjukdom progression. En stor begränsning i att utföra dessa analyser är behovet av specialiserad, dyr utrustning. Här presenteras en billig metod som spårar mus förflyttningar använder lättillgängliga resurser.
6 minuters promenadavstånd är ett mått som ofta används som en klinisk bedömningsverktyg hos individer med Duchennes muskeldystrofi5,6. Ändringar av denna åtgärd har använts för att bedöma resultat i djurmodeller av Duchenne, inklusive mdx mice7 och golden retriever muskeldystrofi (GRMD) hundar8. I den här studien registrerar vi frivilliga öppna fältet rörelse de 6 minuter omedelbart efter en mild träning utmaning. Förflyttningar avståndet beräknades sedan med hjälp av gratis programvara med öppen källkod för att mäta horisontella rörelse över tiden.
Den största fördelen med denna metod är att djur kan testas i en mängd olika inställningar utan att behöva specialutrustning eller dyr kommersiell programvara för analys. En viktig aspekt av denna analys är att det kan utföras i grundläggande laboratoriemiljö utan att behöva flytta eller överföra möss ur ett vivarium till en specialiserad core facility. Det video-tracking-protokollet som beskrivs här kan är väl lämpad att bedömningen av förflyttningar över relativt korta tidsperioder och identifiera aktivitet skillnader mellan vildtyp och mdx mice, samt avslöja funktionell förbättring i en räddning modell av DMD.
Öppna fältet analysen ger ett effektivt och icke-invasiv sätt att testa motorisk funktion i musmodeller av muskelsjukdom och variationer av denna analys kan fungera som en värdefull endpoint åtgärd för prekliniska studier. En stor begränsning med denna typ av analys är höga kostnader och begränsade tillgängligheten av aktivitet övervakningssystem. I denna studie visar vi en billig system för öppna fältet aktivitet analys som kan generera liknande resultat som befintlig kommersiell programvara och utrustni…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av anslag från National Institutes of Health [R01 AR048179 och R01 HL126204 till R.C.W, T32 AR059033 och F32 AR069469to E.M.G] och muskeldystrofi Association USA [274143 och 416364 till R.C.W.].
Video camera | Apple Inc. | ME553LL/A | For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent) |
Kinovea software (version 0.8.15) | Kinovea Association | Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org) | |
iMovie (version 10.0.6) | Apple Inc. | Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional) | |
Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber) | Rubbermaid | # 1778013 | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. |
Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber) | US Acrylic, LLC | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. | |
C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | Male 6 month mice |
C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | Male 6 month mice |
mdx: utrophin-Tg (fiona) | Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies | Male 6 month mice |