Optimale voorbereiding van formaline vaste monsters voor Peptide Matrix gebaseerde bijgestaan Laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging Workflows
Summary
Dit protocol beschrijft een reproduceerbare en betrouwbare methode voor de sublimatie gebaseerde voorbereiding van formaline vaste weefsels die bestemd zijn voor imaging Spectrometrie van de massa.
Abstract
Het gebruik van laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie, Spectrometrie van de massa (MALDI MSI) imaging is snel uitgebreid, aangezien deze techniek een schare van biomoleculen van drugs en lipiden aan N-glycanen analyseert. Hoewel verschillende monster voorbereiding technieken bestaan, blijft opsporen van peptiden van formaldehyde weefsels bewaard een van de moeilijkste uitdagingen voor dit soort massaspectrometrische analyse. Om deze reden hebben we gemaakt en geoptimaliseerd een robuuste methodologie, die de ruimtelijke gegevens die deel uitmaakt van het monster, terwijl het opwekken van het grootste aantal ioniseerbare peptiden behouden blijven. We hebben er ook op gericht om dit te bereiken in een voordelige en eenvoudige manier, zodat er geen potentiële bias of het preparaat fout, die zich voordoen kan wanneer met behulp van instrumentatie geautomatiseerde. Het eindresultaat is een reproduceerbare en goedkope protocol.
Introduction
Laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie imaging (MALDI MSI) heeft gewerkt als een beeld gebaseerde techniek voor twee decennia1,2, analyseren van een aantal biomoleculen inclusief: lipiden3, peptiden2 ,4, eiwitten2,5, metabolieten6,7, N-glycanen8en synthetische moleculen zoals therapeutische drugs9,10. Het aantal publicaties aan te tonen het nut van deze techniek zijn de afgelopen tien jaar6,11,12,13aanzienlijk toegenomen. Bepaalde moleculen, zoals lipiden, zijn relatief eenvoudig te analyseren via MALDI MSI, zoals zij gemakkelijk te als gevolg van de chemische aard ioniseren en dus weinig voorafgaande voorbereiding3 vereisen. Voor moeilijker doelen zoals peptiden zijn de stappen die nodig zijn om effectief deze moleculen ioniseren echter uitgebreid en over het algemeen ingewikkeld14. Momenteel zijn er weinig publicaties die gericht zijn op adres of aantonen van reproduceerbaarheid in de methodologieën die werkzaam zijn voor te bereiden op weefsel deze unieke visuele techniek15. Om deze reden hebben we samengesteld van opmerkingen en geïmplementeerd optimalisaties in één eenvoudig te implementeren, methodologie die weinig tot geen wijziging, voor de analyse van peptides van een formaldehyde moet kruiselings gekoppelde weefsel bron14.
In dit manuscript, hebben we een gevalideerde, low-cost reproduceerbare methodologie voor de detectie en ruimtelijke toewijzing van peptides, gegenereerd op basis van formaline-vaste bevroren (FFF) en formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) weefselsecties beschreven. Deze methodologie niet vereisen of vertrouwen op een gespecialiseerde instrumentatie-3. Specifiek, ingaan we op de vele aspecten van gespecialiseerde monstervoorbereiding noodzakelijk om te analyseren van peptiden; stappen zoals antigeen ophalen16 en matrix coating. Ons protocol maakt ook gebruik van goedkope apparatuur en reagentia, waardoor deze methode toegankelijk te maken voor een bredere gemeenschap die anders zouden kunnen veroorloven de alternatieve robotic apparaat17.
De redenering achter de ontwikkeling van een handmatige monster voorbereiding methode was tweeledig: ten eerste, het gebruik van een sublimator maakt een coherente en homogene deklaag van kristallen van de matrix die ~ 1 µm in lengte18, iets niet haalbaar met de gemeenschappelijkere spuiten technieken. Ten tweede, de relatief kleine set-up kosten: de totale kosten van de aangepaste apparatuur was <$ 1500 AUD. Wij stellen vast, in termen van kosteneffectiviteit, dat de prijs per monster is veel goedkoper als er geen robotachtige machines betrokken. Het gebruik van sublimatie is gemeld eerder, echter tot de beste van onze kennis, stapsgewijze methodologieën die dit proces beschrijven en proef de voorbereiding hebben niet gemeld noch in de literatuur beschreven.
Dit protocol is bedoeld om te helpen van onderzoekers die beschikken over een MALDI-massaspectrometer en wie zijn bedoeling op het genereren van ruimtelijke informatie met betrekking tot een bio-molecule van belang19. In wezen, is MALDI MSI een vorm van histologische screening die niet afhankelijk is van antilichamen of vlekken2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol werd ontworpen om te maximaliseren van de generatie van ioniseerbare moleculaire soorten terwijl het elimineren van de verplaatsing van de analyten. De belangrijkste factoren betrekken met behulp van hetzelfde overkoepelende principe bij de toepassing van de matrix, het verteren van het monster, of recrystallizing na sublimatie24; namelijk, dat een zelfs afzetting van damp, matrix of anders moet worden gemaakt en onderhouden. Pipetteren oplosmiddel wast voor herkristallisatie en spijs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs wil erkennen de Sydney Medical School Foundation en de Blues en de Stichting voor financiering deel van dit werk door middel van hun PhD scholarship programma voor onderzoek van de ziekte van Alzheimer en een ARC Discovery subsidie (DP160102063) tot PKW.
Materials
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | For preparation and section of tissue. |
| Indium Tin Oxide Microscope slides | Bruker | 8237001 | For preparation and section of tissue. |
| Coplin Jars | Sigma Aldrich | S5516 | For preparation and section of tissue. |
| Pressure Cooker | Kambrook | KPR620BSS | For preparation and section of tissue. |
| Sublimator | Chem Glass | NA | For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made |
| Sand bath | NA | NA | For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company |
| Glass Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS70165100 | For sublimation procedure. |
| Vacuum Pump | NA | NA | For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer |
| Cold trap | Chem Glass | CG-4510-02 | For sublimation procedure. |
| Hot Plate | John Morris | EW-15956-32. | For sublimation procedure. |
| Plastic petri dish | Sigma Aldrich | Z717223 | For sublimation procedure. |
| 37 °C incubator | NA | NA | For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old |
| Blotting paper | Sigma Aldrich | P7796 | For sublimation procedure. |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8395 | For washing of slides. |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | For washing of slides. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | For washing of slides. |
| 100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | For washing of slides. |
| 70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432 | For washing of slides. |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | For washing of slides. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8 |
| Milli Q Ultra-Pure Water | Sigma Aldrich | NA | For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system |
| Ammonium Bircarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | For proteolytic cleavage. |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T0303 | For proteolytic cleavage. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | For recrystallisation. |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | For recrystallisation. |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | For recrystallisation. |
References
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
- Jackson, S. N., et al. MALDI-Ion Mobility Mass Spectrometry of Lipids in Negative Ion Mode. Analytical methods : advancing methods and applications. 6 (14), 5001-5007 (2014).
- O’Rourke, M. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A non-instrument-based method for the analysis of formalin-fixed paraffin-embedded human spinal cord via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (19), 1836-1840 (2015).
- O’Rourke, M. B., Raymond, B. B. A., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (7), 637-644 (2015).
- Chughtai, K., Heeren, R. M. Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chem Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75 (1), 130-145 (2013).
- Powers, T. W., et al. MALDI imaging mass spectrometry profiling of N-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays. PLoS One. 9 (9), 10655 (2014).
- Rompp, A., Spengler, B. Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space. Histochem Cell Biol. 139 (6), 759-783 (2013).
- Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andren, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
- Alexandrov, T. MALDI imaging mass spectrometry: statistical data analysis and current computational challenges. BMC Bioinformatics. 13, 11 (2012).
- Weaver, E. M., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures. Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).
- Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nat Rev Microbiol. 9 (9), 683-694 (2011).
- O’Rourke, M., Padula, M. The Non-Instrument Based Preparation of Tissue Samples Destined for Imaging Mass Spectrometry (IMS) Analysis. Protocol Exchange. , (2017).
- O’Rourke, M. B., Padula, M. P. A new standard of visual data representation for imaging mass spectrometry. Proteomics Clin Appl. 11 (3-4), (2017).
- O’Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Casadonte, R., Caprioli, R. M. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry. Nat. Protocols. 6 (11), 1695-1709 (2011).
- Ong, T. H., et al. Mass Spectrometry Imaging and Identification of Peptides Associated with Cephalic Ganglia Regeneration in Schmidtea mediterranea. J Biol Chem. 291 (15), 8109-8120 (2016).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
- . Blood-smear showing Experimental Infection with Herpetomonas. Proc R Soc Med. 18, 55 (1925).
- Gorrie, C. A., et al. Effects of human OEC-derived cell transplants in rodent spinal cord contusion injury. Brain Res. 1337, 8-20 (2010).
- Wu, Q., Comi, T. J., Li, B., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. On-Tissue Derivatization via Electrospray Deposition for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging of Endogenous Fatty Acids in Rat Brain Tissues. Anal Chem. 88 (11), 5988-5995 (2016).
- Sturm, R. M., Greer, T., Chen, R., Hensen, B., Li, L. Comparison of NIMS and MALDI platforms for neuropeptide and lipid mass spectrometric imaging in C. borealis brain tissue. Anal Methods. 5 (6), 1623-1628 (2013).
- Kompauer, M., Heiles, S., Spengler, B. Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-mum lateral resolution. Nat Methods. 14 (1), 90-96 (2017).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).
- Rohner, T. C., Staab, D., Stoeckli, M. MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections. Mech Ageing Dev. 126 (1), 177-185 (2005).
- Li, B., Bhandari, D. R., Rompp, A., Spengler, B. High-resolution MALDI mass spectrometry imaging of gallotannins and monoterpene glucosides in the root of Paeonia lactiflora. Sci Rep. 6, 36074 (2016).
- Spengler, B. Mass spectrometry imaging of biomolecular information. Anal Chem. 87 (1), 64-82 (2015).
- Widlak, P., et al. Detection of molecular signatures of oral squamous cell carcinoma and normal epithelium – application of a novel methodology for unsupervised segmentation of imaging mass spectrometry data. Proteomics. 16 (11-12), 1613-1621 (2016).
