Optimale Vorbereitung von Formalin fixiert Proben für Peptid-Matrix basierten Assisted Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie Imaging-Workflows
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare und zuverlässige Methode für die Sublimation-basierte Erstellung von Formalin fixiert Gewebe für bildgebende Massenspektrometrie bestimmt.
Abstract
Die Verwendung von Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung hat Massenspektrometrie imaging (MALDI MSI) schnell erweitert, da diese Technik eine Vielzahl von Biomolekülen von Drogen und Lipide zu N-Glykane analysiert. Obwohl verschiedene Probe Präparationstechniken vorhanden, bleibt Erkennung Peptide aus Formaldehyd konserviert Gewebe eine der schwierigsten Herausforderungen für diese Art der massenspektrometrischen Analyse. Aus diesem Grund haben wir erstellt und optimiert eine robuste Methode, die die räumliche Informationen innerhalb der Probe, während die größte Anzahl an ionizable Peptide zu entlocken bewahrt. Wir haben auch zum Ziel, zu erreichen dies in eine kostengünstige und einfache Möglichkeit, wodurch möglichen Voreingenommenheit oder Vorbereitung Fehler, die auftreten kann, wenn mit Instrumenten automatisierten. Das Endergebnis ist eine reproduzierbare und kostengünstige Protokoll.
Introduction
Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie imaging (MALDI MSI) als Bild-basierte Technik für zwei Jahrzehnte1,2, eine Reihe von Biomolekülen einschließlich Analyse beschäftigt: Lipide3, Peptide2 ,4, Proteine2,5, Metaboliten6,7, N-Glykane8und synthetische Moleküle wie z. B. Medikamente9,10. Die Anzahl der Publikationen zeigen die Nützlichkeit dieser Technik sind deutlich über der letzten Dekade6,11,12,13gewachsen. Bestimmte Moleküle wie Lipide, sind relativ einfach, über MALDI MSI zu analysieren, wie sie leicht aufgrund ihrer chemischen Natur ionisieren und erfordern daher wenig Vorbereitung3. Jedoch sind die Schritte erforderlich, um effektiv diese Moleküle ionisieren für schwieriger Ziele wie Peptide, umfangreich und in der Regel kompliziert14. Derzeit gibt es nur wenige Veröffentlichungen, die darauf abzielen, Adresse oder demonstrieren Reproduzierbarkeit in den Methoden, die eingesetzt werden, um Gewebe für dieses einzigartige visuelle Technik15vorzubereiten. Aus diesem Grund haben wir zusammengestellt, Beobachtungen und Optimierungen umgesetzt in einer einzigen, einfach zu implementieren, Methodik, die wenig bis gar keine Änderung für die Analyse von Peptiden aus einem Formaldehyd erfordern sollte vernetzt Gewebe Quelle14.
In dieser Handschrift haben wir eine validierte, low-cost reproduzierbare Methode zum Nachweis und zur räumlichen Zuordnung von Peptiden, generiert von Formalin fixiert gefroren (FFF) und Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeschnitte beschrieben. Diese Methode erfordert und verlassen Sie sich auf spezielle Instrumentierung3. Insbesondere gehen wir auf die vielen Aspekte der spezialisierten Probenvorbereitung notwendig, Peptide zu analysieren; Schritte wie Antigen-Retrieval-16 und Matrix-Beschichtung. Unser Protokoll nutzt auch preiswerte Geräte und Reagenzien, wodurch diese Methodik zugänglich zu einer größeren Gemeinschaft, die sonst nicht die Alternative Roboter Apparat17leisten.
Die Beweggründe für die Entwicklung einer manuellen Probe Vorbereitung Methode hatte zwei Ziele: Erstens die Verwendung von einem Sublimator schafft eine konsistente und homogene Beschichtung von Matrix-Kristalle, ~ 1 µm Länge18, etwas Unerreichbares mit häufiger Spritzen sind, Techniken. Zweitens die relativ kleine Einrichtung Kosten: die Gesamtkosten für den benutzerdefinierten Apparat war <$ 1500 AUD. Wir beachten Sie, dass in Bezug auf Wirtschaftlichkeit, der Preis pro Probe viel billiger ist, wenn keine Roboter Maschinen beteiligt ist. Die Verwendung von Sublimation wurde zuvor jedoch nach bestem Wissen und Gewissen, berichtet schrittweise Methoden, die diesen Prozess beschreiben und Probenvorbereitung nicht berichtet noch in der Literatur beschrieben worden.
Dieses Protokoll soll Forscher zu unterstützen, Zugang zu einem MALDI-Massenspektrometer und die Absicht auf die Generierung von räumlichen Informationen in Bezug auf ein Bio-Molekül des Interesses19. MALDI MSI ist im Wesentlichen eine Form der histologischen screening, verlässt sich nicht auf Antikörper oder2Flecken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Generation der ionizable Molekülsorten ohne Verlagerung des Analyten zu maximieren. Die Schlüsselfaktoren betreffen mit dem gleichen oberstes Prinzip bei der Matrix, die Probe zu verdauen, oder recrystallizing nach Sublimation24Anwendung; nämlich, dass eine sogar Ablagerung von Dampf, Matrix oder andernfalls erstellt und gepflegt werden muss. Pipettieren Lösungsmittel wäscht für Rekristallisation und Verdauung, gleichmäßig unter der Probe verhinder…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchte Sydney Medical School Foundation und Blues und Stiftung für die Finanzierung Bestandteil dieser Arbeit durch ihre PhD-Stipendien-Programm für die Alzheimer-Krankheit-Forschung und ein ARC Entdeckung Zuschuss (DP160102063), PKW anerkennen.
Materials
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | For preparation and section of tissue. |
| Indium Tin Oxide Microscope slides | Bruker | 8237001 | For preparation and section of tissue. |
| Coplin Jars | Sigma Aldrich | S5516 | For preparation and section of tissue. |
| Pressure Cooker | Kambrook | KPR620BSS | For preparation and section of tissue. |
| Sublimator | Chem Glass | NA | For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made |
| Sand bath | NA | NA | For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company |
| Glass Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS70165100 | For sublimation procedure. |
| Vacuum Pump | NA | NA | For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer |
| Cold trap | Chem Glass | CG-4510-02 | For sublimation procedure. |
| Hot Plate | John Morris | EW-15956-32. | For sublimation procedure. |
| Plastic petri dish | Sigma Aldrich | Z717223 | For sublimation procedure. |
| 37 °C incubator | NA | NA | For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old |
| Blotting paper | Sigma Aldrich | P7796 | For sublimation procedure. |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8395 | For washing of slides. |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | For washing of slides. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | For washing of slides. |
| 100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | For washing of slides. |
| 70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432 | For washing of slides. |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | For washing of slides. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8 |
| Milli Q Ultra-Pure Water | Sigma Aldrich | NA | For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system |
| Ammonium Bircarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | For proteolytic cleavage. |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T0303 | For proteolytic cleavage. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | For recrystallisation. |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | For recrystallisation. |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | For recrystallisation. |
References
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