Óptima preparación de formol fijada muestras para péptidos basados en matriz asistida por láser de desorción/ionización espectrometría de masas de flujos de trabajo
Summary
Este protocolo describe un método reproducible y confiable para la preparación a base de la sublimación de formalina fijada destinado para el spectrometry total de la proyección de imagen del tejido.
Abstract
El uso de desorción/ionización láser asistida por matriz, espectrometría de masas (MALDI MSI) la proyección de imagen se expandió rápidamente, ya que esta técnica analiza una serie de biomoléculas de las drogas y los lípidos a N-glycans. Aunque existen diversas técnicas de preparación de muestras, detección de péptidos del formaldehído conservada los tejidos sigue siendo uno de los retos más difíciles para este tipo de análisis de espectrometría de masa. Por esta razón, hemos creado y optimizado una robusta metodología que conserva la información espacial contenida en la muestra, mientras que el mayor número de péptidos ionizables. También hemos destinado para lograrlo de una manera simple y rentable, eliminando así posibles error de sesgo o preparación, que puede ocurrir cuando utiliza instrumentación. El resultado final es un protocolo reproducible y de bajo costo.
Introduction
Espectrometría de masas del desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI MSI) la proyección de imagen ha sido empleada como una técnica de imagen basado en dos décadas1,2, análisis de una gama de biomoléculas, incluyendo: lípidos3, péptidos2 ,4, proteínas2,5, metabolitos6,7, N-glycans8y moléculas sintéticas como drogas terapéuticas9,10. El número de publicaciones que demuestran la utilidad de esta técnica ha crecido significativamente durante la última década6,11,12,13. Ciertas moléculas tales como lípidos, son relativamente fáciles de analizar mediante MALDI MSI, que se ionizan fácilmente debido a su naturaleza química y por lo tanto requieren poca preparación previa3. Sin embargo, para alcanzar las metas más difíciles tales como péptidos, los pasos necesarios para ionizar con eficacia estas moléculas son amplia y generalmente complicados14. Actualmente existen muy pocas publicaciones que apuntan a la dirección o demuestran reproducibilidad en las metodologías que se emplean para preparar el tejido para esta técnica visual única15. Por esta razón, hemos compilado las observaciones e implementadas optimizaciones en una única, fácil de implementar, metodología que no debería requerir poca o ninguna modificación, para el análisis de péptidos de un formaldehído reticulado tejido fuente14.
En este manuscrito, hemos descrito una metodología reproducible validada y bajo costo para la detección y asignación espacial de péptidos, generados a partir de formalina-fijos congelado (FFF) y secciones de tejido de formalina-fijo de parafina-encajadas (FFPE). Esta metodología no requiere ni confiar en cualquier instrumentación especializada3. En concreto, abordar los aspectos de la preparación de la muestra especializada necesario analizar péptidos; pasos como antígeno recuperación16 y recubrimiento de la matriz. Nuestro protocolo también utiliza equipo barato y reactivos, lo cual esta metodología accesible a una comunidad más amplia que de lo contrario sería incapaz de permitirse la alternativa aparato robótico17.
El razonamiento detrás de desarrollar un método de preparación manual de las muestras fue doble: en primer lugar, el uso de un sublimator crea una capa homogénea y consistente de cristales matriz ~ 1 μm de longitud18, algo inalcanzable con la pulverización más comunes técnicas. En segundo lugar, el conjunto relativamente pequeño los costos: el costo total del aparato de medida fue < AUD $1500. Observamos, en términos de rentabilidad, que el precio por muestra es mucho más barato cuando no hay ninguna maquinaria robotizada. El uso de la sublimación se ha divulgado previamente, sin embargo, a lo mejor de nuestro conocimiento, metodologías paso a paso que describen este proceso y preparación de muestras no han sido registrados ni descrito en la literatura.
Este protocolo está diseñado para ayudar a los investigadores que tienen acceso a un espectrómetro de masas MALDI y que están determinados en la generación de información espacial en relación con una bio-molécula de interés19. En esencia, MALDI MSI es una forma de histológico de detección no depende de los anticuerpos o las manchas de2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo fue diseñado para maximizar la generación de especies moleculares ionizables eliminando deslocalización de analitos. Los factores clave incluyen usando el mismo principio primordial al aplicar la matriz, digerir la muestra o recristalización después de la sublimación24; es decir, que una incluso deposición de vapor, de matriz o de lo contrario, debe ser creado y mantenido. Pipeteo lavados solvente para recristalización y la digestión, uniformemente por debajo de la muestra,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer la Fundación de escuela médica de Sydney y azul y Fundación para la financiación de parte de este trabajo a través de su programa de becas de doctorado para la investigación de la enfermedad de Alzheimer y una subvención del descubrimiento del arco (DP160102063) otorgado a PKW.
Materials
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | For preparation and section of tissue. |
| Indium Tin Oxide Microscope slides | Bruker | 8237001 | For preparation and section of tissue. |
| Coplin Jars | Sigma Aldrich | S5516 | For preparation and section of tissue. |
| Pressure Cooker | Kambrook | KPR620BSS | For preparation and section of tissue. |
| Sublimator | Chem Glass | NA | For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made |
| Sand bath | NA | NA | For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company |
| Glass Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS70165100 | For sublimation procedure. |
| Vacuum Pump | NA | NA | For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer |
| Cold trap | Chem Glass | CG-4510-02 | For sublimation procedure. |
| Hot Plate | John Morris | EW-15956-32. | For sublimation procedure. |
| Plastic petri dish | Sigma Aldrich | Z717223 | For sublimation procedure. |
| 37 °C incubator | NA | NA | For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old |
| Blotting paper | Sigma Aldrich | P7796 | For sublimation procedure. |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8395 | For washing of slides. |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | For washing of slides. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | For washing of slides. |
| 100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | For washing of slides. |
| 70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432 | For washing of slides. |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | For washing of slides. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8 |
| Milli Q Ultra-Pure Water | Sigma Aldrich | NA | For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system |
| Ammonium Bircarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | For proteolytic cleavage. |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T0303 | For proteolytic cleavage. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | For recrystallisation. |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | For recrystallisation. |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | For recrystallisation. |
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