Optimal förberedelse av formalinbeständiga prover för peptid baserat Matrix assisterad Laser Desorption/jonisering masspektrometri Imaging arbetsflöden
Summary
Det här protokollet beskriver en reproducerbar och pålitlig metod för sublimering-baserade beredning av formalinbeständiga vävnad avsedd för imaging masspektrometri.
Abstract
Användning av matrix-assisted laser desorption/jonisering, masspektrometri imaging (MALDI MSI) har snabbt expanderat, eftersom denna teknik analyserar en värd av biomolekyler från droger och lipider till N-glycans. Även om olika provberedningstekniker finns, förblir att upptäcka peptider från formaldehyd bevarade vävnader en av de svåraste utmaningarna för denna typ av massa spektrometriska analys. Därför har vi skapat och optimerat en robust metod som bevarar den rumsliga informationen i provet, medan framkalla det största antalet joniseringsbara peptider. Vi har också syftar till att uppnå detta på ett enkelt och kostnadseffektivt sätt, vilket eliminerar potentiella bias eller beredning fel, som kan uppstå när du använder automatisk instrumentering. Slutresultatet är ett reproducerbart och billig protokoll.
Introduction
Matrix-assisted laser desorption/jonisering masspektrometri imaging (MALDI MSI) har varit anställd som en bild baserad teknik för två decennier1,2, analysera en rad biomolekyler inklusive: lipider3, peptider2 ,4, proteiner2,5, metaboliter6,7, N-glycans8och syntetiska molekyler såsom terapeutiska läkemedel9,10. Antalet publikationer visar nyttan av denna teknik har vuxit betydligt under de senaste decenniet6,11,12,13. Vissa molekyler, såsom lipider, är relativt lätt att analysera via MALDI MSI, som de jonisera lätt på grund av sin kemiska natur och därmed kräver lite tidigare beredning3. Men för svårare mål såsom peptider är stegen som krävs för att effektivt jonisera dessa molekyler omfattande och allmänt komplicerade14. Närvarande finns det mycket få publikationer som syftar till att adress eller påvisa reproducerbarhet i de metoder som används för att förbereda vävnad för denna unika visuella teknik15. Därför har vi sammanställt observationer och genomfört optimeringar till en enda, enkel att genomföra, metodik som bör kräva lite till ingen modifiering, för analys av peptider från en formaldehyd tvärbunden vävnad källa14.
I detta manuskript, har vi beskrivit en validerad, låg kostnad reproducerbar metod för detektering och spatial kartläggning av peptider, genereras från formalin-fasta frysta (FFF) och formalin-fast paraffin-inbäddat (FFPE) vävnadssnitt. Denna metod inte kräver eller förlita sig på någon specialiserad instrumentation3. Specifikt, vi tar itu med de många aspekterna av specialiserade provberedning nödvändigt att analysera peptider; steg som antigen retrieval16 och matrix beläggning. Våra protokoll använder också billig utrustning och reagenser, vilket gör denna metod tillgänglig för en bredare gemenskap som annars inte har råd den alternativa robotic apparater17.
Resonemanget bakom utveckla en manuell prov förberedelse metod var tvåfaldigt: för det första användningen av en sublimator skapar en konsekvent och homogen beläggning av matrix kristaller som är ~ 1 µm i längd18, något ouppnåeligt med vanligare sprutning tekniker. För det andra, relativt litet Ställ kostnader: den totala kostnaden av anpassade apparater var <$ 1500 AUD. Vi noterar när det gäller kostnadseffektivitet, priset per prov är långt billigare när det finns inga automatiska maskiner inblandade. Användning av sublimering har rapporterats tidigare, men bäst av vår kunskap, steg för steg metoder som beskriver denna process och provberedning inte har rapporterats eller beskrivna i litteraturen.
Detta protokoll syftar till att bistå forskare som har tillgång till en MALDI masspektrometer och som är inställda på att generera rumslig information i förhållande till en bio-molekyl intresse19. I huvudsak är MALDI MSI en form av histologiska screening som inte bygger på antikroppar eller fläckar2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll var utformad för att maximera generationen av joniseringsbara molekylstorleken samtidigt eliminera omlokaliseringar av analyter. De viktigaste faktorerna involverar använder samma tvingande principen vid applicering matris, smälta provet eller recrystallizing efter sublimering24; nämligen, att en även nedfall av ånga, matris eller annars måste skapas och underhållas. Pipettering lösningsmedel tvättar för omkristallisering och matsmältning, jämnt under provet, förhindr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna Sydney Medical School Foundation och Blues och Stiftelsen för att finansiera en del av detta arbete genom deras PhD scholarship program för Alzheimers Sjukdomforskning och en ARC Discovery bidrag (DP160102063) till PKW.
Materials
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | For preparation and section of tissue. |
| Indium Tin Oxide Microscope slides | Bruker | 8237001 | For preparation and section of tissue. |
| Coplin Jars | Sigma Aldrich | S5516 | For preparation and section of tissue. |
| Pressure Cooker | Kambrook | KPR620BSS | For preparation and section of tissue. |
| Sublimator | Chem Glass | NA | For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made |
| Sand bath | NA | NA | For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company |
| Glass Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS70165100 | For sublimation procedure. |
| Vacuum Pump | NA | NA | For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer |
| Cold trap | Chem Glass | CG-4510-02 | For sublimation procedure. |
| Hot Plate | John Morris | EW-15956-32. | For sublimation procedure. |
| Plastic petri dish | Sigma Aldrich | Z717223 | For sublimation procedure. |
| 37 °C incubator | NA | NA | For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old |
| Blotting paper | Sigma Aldrich | P7796 | For sublimation procedure. |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8395 | For washing of slides. |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | For washing of slides. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | For washing of slides. |
| 100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | For washing of slides. |
| 70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432 | For washing of slides. |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | For washing of slides. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8 |
| Milli Q Ultra-Pure Water | Sigma Aldrich | NA | For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system |
| Ammonium Bircarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | For proteolytic cleavage. |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T0303 | For proteolytic cleavage. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | For recrystallisation. |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | For recrystallisation. |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | For recrystallisation. |
References
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
- Jackson, S. N., et al. MALDI-Ion Mobility Mass Spectrometry of Lipids in Negative Ion Mode. Analytical methods : advancing methods and applications. 6 (14), 5001-5007 (2014).
- O’Rourke, M. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A non-instrument-based method for the analysis of formalin-fixed paraffin-embedded human spinal cord via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (19), 1836-1840 (2015).
- O’Rourke, M. B., Raymond, B. B. A., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (7), 637-644 (2015).
- Chughtai, K., Heeren, R. M. Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chem Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75 (1), 130-145 (2013).
- Powers, T. W., et al. MALDI imaging mass spectrometry profiling of N-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays. PLoS One. 9 (9), 10655 (2014).
- Rompp, A., Spengler, B. Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space. Histochem Cell Biol. 139 (6), 759-783 (2013).
- Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andren, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
- Alexandrov, T. MALDI imaging mass spectrometry: statistical data analysis and current computational challenges. BMC Bioinformatics. 13, 11 (2012).
- Weaver, E. M., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures. Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).
- Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nat Rev Microbiol. 9 (9), 683-694 (2011).
- O’Rourke, M., Padula, M. The Non-Instrument Based Preparation of Tissue Samples Destined for Imaging Mass Spectrometry (IMS) Analysis. Protocol Exchange. , (2017).
- O’Rourke, M. B., Padula, M. P. A new standard of visual data representation for imaging mass spectrometry. Proteomics Clin Appl. 11 (3-4), (2017).
- O’Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Casadonte, R., Caprioli, R. M. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry. Nat. Protocols. 6 (11), 1695-1709 (2011).
- Ong, T. H., et al. Mass Spectrometry Imaging and Identification of Peptides Associated with Cephalic Ganglia Regeneration in Schmidtea mediterranea. J Biol Chem. 291 (15), 8109-8120 (2016).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
- . Blood-smear showing Experimental Infection with Herpetomonas. Proc R Soc Med. 18, 55 (1925).
- Gorrie, C. A., et al. Effects of human OEC-derived cell transplants in rodent spinal cord contusion injury. Brain Res. 1337, 8-20 (2010).
- Wu, Q., Comi, T. J., Li, B., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. On-Tissue Derivatization via Electrospray Deposition for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging of Endogenous Fatty Acids in Rat Brain Tissues. Anal Chem. 88 (11), 5988-5995 (2016).
- Sturm, R. M., Greer, T., Chen, R., Hensen, B., Li, L. Comparison of NIMS and MALDI platforms for neuropeptide and lipid mass spectrometric imaging in C. borealis brain tissue. Anal Methods. 5 (6), 1623-1628 (2013).
- Kompauer, M., Heiles, S., Spengler, B. Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-mum lateral resolution. Nat Methods. 14 (1), 90-96 (2017).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).
- Rohner, T. C., Staab, D., Stoeckli, M. MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections. Mech Ageing Dev. 126 (1), 177-185 (2005).
- Li, B., Bhandari, D. R., Rompp, A., Spengler, B. High-resolution MALDI mass spectrometry imaging of gallotannins and monoterpene glucosides in the root of Paeonia lactiflora. Sci Rep. 6, 36074 (2016).
- Spengler, B. Mass spectrometry imaging of biomolecular information. Anal Chem. 87 (1), 64-82 (2015).
- Widlak, P., et al. Detection of molecular signatures of oral squamous cell carcinoma and normal epithelium – application of a novel methodology for unsupervised segmentation of imaging mass spectrometry data. Proteomics. 16 (11-12), 1613-1621 (2016).
