כתב יד זה מתאר איך חתך דמוי נגעים על monolayers בתרבית תאים אפיתל בנוחות דגם פצע ריפוי במבחנה, ומאפשר הדמיה על ידי קונאפוקלית או סריקה מיקרוסקופ לייזר, אשר יכול לספק באיכות גבוהה נתונים כמותיים ואיכותיים ללמוד בהתנהגות התא והן את המנגנונים המעורבים בהעברה.
נדידת תאים הוא היבט חובה עבור ריפוי הפצע. יצירה מלאכותית פצעים בדגמים בעלי חיים למחקר לעיתים קרובות תוצאות בפרוצדורות ניסיוני יקר ומסובך, בעוד פוטנציאלי חסר דיוק. In vitro לקשרי תרבות של שורות תאים אפיתל מספק הפלטפורמה המתאימה עבור חוקר ההתנהגות נודדות תא ריפוי הפצע, את ההשפעה של טיפולים על תאים אלה. הפיזיולוגיה של תאים אפיתל לעיתים קרובות נלמדת בתנאים שאינם-confluent; עם זאת, גישה זו אולי לא מזכירים ריפוי בתנאים טבעיים הפצע. לשבש את תקינות אפיתל באמצעים מכניים יוצר מודל מציאותי, אך עשוי לעכב את היישום של טכניקות מולקולריות. כתוצאה מכך, טכניקות במיקרוסקופ מבוסס הם אופטימליים ללימוד נדידת תאים אפיתל במבחנה. כאן אנחנו מפרטים שתי שיטות ספציפיות, וזמינותו גירוד פצע מלאכותי, וזמינותו קבלה העברה מלאכותית, תועמד נתונים כמותיים ואיכותניים, בהתאמה, על הביצועים הנדידה של תאים אפיתל.
נדידת תאים דרוש לריפוי הפצע, כפי שהוא אחראי על הסגר הסופי של הפער אפיתל ושיקום של פני השטח שיבשו1. ביצוע פצעים מלאכותי בבעלי חיים מאפשר להקים את ההעתק של תהליך מורכב זה ליד בתנאים פיזיולוגיים2. עם זאת, גישה זו לעתים קרובות התוצאות נהלים ניסיוני יקר ומסובך, שעשוי להיות חסרי דיוק לחקר תהליכים ברורים, בשל אופיו המורכב של תהליך ריפוי פצע.
In vitro לקשרי תרבות של שורות תאים אפיתל מספק אלטרנטיבה מועיל חייתיים לחקור את התפקיד כי תאים אלה לשחק ב ריפוי הפצע ואת ההשפעות של טיפול להתנהגות הנדידה התא. הפיזיולוגיה של תאים אפיתל לעיתים קרובות נלמדת על ידי טכניקות מולקולריות באמצעות התרבויות הלא-confluent3,4,5,6; עם זאת, שיבוש שלמות אפיתל בדרך כלל מושגת על ידי חתכים מכני טוב. בתרבות תא, זה מרמז כי עלול להיות חשוף זניח מספר התאים הפער הפצע, הם מייצגים מדגם קטן מדי עבור שיטות בביולוגיה מולקולרית. עם זאת, נגעים אלה ניתן יהיה ללמוד את קנה המידה מיקרוסקופיים, מנצל המאפיינים נודדות מולדת של שורות תאים אפיתל מסוימים, כגון התא מינק ריאות אפיתל (Mv1Lu) או את התא באופן ספונטני מונצחים אנושי תקין (HaCaT) קווים.
כאן אנחנו תיאר שיטה מיקרוסקופ מתאימה לקבל נתונים כמותיים על ההעברה של תאי אפיתל כנגד בהקשר של3,–4,–7,–8ריפוי הפצע. יתר על כן, אנו מציגים נוספים בשיטות שאינן מועילות ללמוד שינויים מורפולוגיים המולקולריים איכותית המתרחשים monolayers אפיתל במהלך ההעברה. בסך הכל, שיטות אלה מספקים מסגרת ללמוד dynamics והן שינויים מורפולוגיים מעורב עם תאים אפיתל התנהגות בתגובה טיפולים במהלך ריפוי הפצע.
על העור או קרום רירי השיבושים, הפונקציה מכשול משוחזר על ידי הפעולות של סוגי תאים רבים, לרבות fibroblasts תאים אפיתל ואת המערכת החיסונית. בצמדים, תאים אלו עוברים מתחם פרוצס מעורבים אפופטוזיס, התפשטות, בידול, חשוב, פיברובלסט ואפיתל תא ההעברה, אשר הוא מנגנון האולטימטיבי האחראי על שיקום של הרקמה שיב?…
The authors have nothing to disclose.
אנחנו רוצים לתת תודות לחברים ישנים יותר של המעבדה המסייעים לשפר, לשכלל את הטכניקות האלו למצבו בפועל: ד ר סיליה מרטינז-Mora; ד ר אנה Mrowiec, ד ר קטלינה רואיז-Cañada, ד”ר אנטוניה אלקאראז-גארסיה…. . אנחנו חבים החולים Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca לתמיכה בחריפות את הפיתוח של טכניקות אלה. גם אינסטיטוטו דה סאלוד Carlos III, Fondo דה Investigaciones Sanitarias. תוכנית Estatal אני + D + אני ואת אינסטיטוטו דה סאלוד קרלוס השלישי-Subdirección גנרל דה Evaluación y מטאליסט de la Investigación (מענק מס: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos פדר “Una בדרך זו דה ש אירופה”. אנו מודים גם למד דה מורסיה, IMIB-Arrixaca ו- FFIS עבור מנהלי תמיכה וסיוע. לבסוף, אנחנו רוצים לתת תודה ד ר איזבל Martínez-Argudo, את Facultad עצמה Ambientales y Bioquímica, קמפוס Tecnológico de la Fábrica דה ארמאס, למד קסטיליה לה מנצ’ה, טולדו על תמיכתם סוג של ויתור מרצון מיוחדת וההתערבות והמעבדה ביוטכנולוגיה לעשות אפשרי החלק מצולם של מאמר זה.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |