Bu el yazması kültürlü epitel hücre monolayers üzerinde yapılan nasıl kesi benzeri lezyonlar elverişli bir konuma sahip modeli şifa vitrogörüntüleme için tarafından confocal sağlayan, yarası. açıklar veya lazer tarama mikroskobu ve yüksek kaliteli sağlayabilir nicel ve nitel veri hücre davranış ve mekanizmaları geçişinde dahil çalışmak için.
Hücre göç yara iyileşmesi için zorunlu bir yönüdür. Yapay oluşturma araştırma hayvan modellerinde genellikle pahalı ve karmaşık deneysel prosedürler sonuçlarında potansiyel hassas eksik ise yaralar. Vitro kültür epitel hücre hatları yara iyileşmesi ve tedaviler bu hücrelerde etkisini hücre göç davranışlara araştırma için uygun bir platform sağlar. Epitel hücrelerinin fizyolojisi kez birleşmesi olmayan koşullarda okudu; Ancak, bu yaklaşım koşulları şifa doğal yara benzemeyebilir. Mekanik yollarla epitel bütünlüğünü bozan gerçekçi bir model oluşturur, ancak moleküler tekniklerin uygulanması engelleyebilir. Sonuç olarak, temel mikroskobu teknikleri epitel hücre geçiş eğitimi için en iyi durumda tüp bebek. Burada iki belirli yöntemleri, yapay yara karalama tahlil ve nicel ve nitel veri, sırasıyla, epitel hücreleri göçmen performansı üzerinde elde edebilirsiniz yapay geçiş açık tahlil, ayrıntılı.
Epitel boşluğu son kapatılması ve kesintiye yüzey1restorasyonu için sorumlu olduğu gibi hücre göç yara iyileşmesi için gereklidir. Hayvan modellerinde yapay yaraları yapmadan karmaşık bu süreçte fizyolojik şartlarda2yakınındaki çoğaltma olanağı sağlar. Ancak, bu yaklaşım genellikle potansiyel olarak farklı süreçler, yara iyileşme süreci karmaşık doğası gereği incelenmesi için duyarlık eksikliği pahalı ve karmaşık deneysel prosedürler, sonuç.
Vitro kültür epitel hücre hatları bu hücreler yara iyileşmesi ve hücre göç davranışı üzerinde tedavinin etkilerini oynamak rol araştırma için hayvan modelleri için yararlı bir alternatif sağlar. Epitel hücrelerinin fizyolojisi tarafından Moleküler teknikleri kullanarak birleşmesi kültürler3,4,5,6kez okudu; Ancak, epitel bütünlüğünü bozulma genellikle iyi mekanik insizyon tarafından sağlanır. Hücre kültüründe bu ihmal edilebilir hücre sayısı için yara boşluğu maruz kalabileceğinizi ve moleküler biyoloji teknikleri için çok küçük bir örnek temsil ettikleri anlamına gelir. Ancak, bu lezyonlar vizon akciğer epitel hücre (Mv1Lu) veya kendiliğinden ölümsüzleştirdi insan keratinosit (HaCaT) hücre gibi bazı epitel hücre hatları doğuştan gelen göçmen özelliklerini yararlanarak mikroskobik ölçek okudu olabilir satırları.
Burada nicel veriler üzerinde geçiş3,4,7,8şifa yara bağlamında epitel hücrelerinin elde etmek uygundur mikroskopi için bir yöntem açıklanmıştır. Ayrıca, biz niteliksel moleküler ve morfolojik değişiklikler üzerinde epitel monolayers geçiş sırasında meydana gelen eğitim yararlı ek yöntemler mevcut. Genel olarak, bu yöntemleri yara iyileşmesi sırasında dinamikleri ve morfolojik değişiklikler epitel hücre davranış ve yanıt-e doğru tedaviler ile ilgili çalışma için bir çerçeve sağlar.
Cilt veya mukoz kesintileri bariyer fonksiyonu fibroblastlar veya epitel ve bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipleri eylemleri ile geri yüklenir. Manivela, tabi bu hücreler karmaşık bir işlem apoptosis, nükleer silahların yayılmasına karşı farklılaşma ve önemlisi, fibroblast ve epitel hücre göç, son mekanizması kesintiye dokusunun restorasyonu için sorumlu olan ve Tam da yara tedavisi düzenleyici potansiyelini belirlenirken epitel hücreleri, fizyolojik davranışı…
The authors have nothing to disclose.
Biz geliştirmek ve fiili duruma bu teknikleri rafine yardımcı eski üyeleri laboratuarının sayesinde vermek istiyorum: Dr Celia Martinez-Mora; Dr Anna Mrowiec, Dr Catalina Ruiz-Canada’da ve Dr Antonia Alcaraz-García. Biz kuvvetle bu tekniklerin gelişimi desteklemek için hastane Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca için borçlu bulunmaktadır. Ayrıca Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Estatal planı ben + D + ı ve Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (Grant No: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER “Una manera de hacer Europa”. Biz Ayrıca Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca ve FFIS idari destek ve yardım için teşekkür ederiz. Sonunda, biz özel bir Doktor Isabel Martínez-Argudo ve Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, kampüs Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla la Mancha, Toledo isteyerek sigorta içinde tür destek için teşekkür vermek istiyorum Biyomedikal ve biyoteknoloji filme bu kağıt parçası mümkün kılmak için laboratuvar.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |