Microscopia com base em métodos de avaliação da migração de células epiteliais durante a cicatrização em Vitro
Summary
Este manuscrito descreve como incisão lesões-feitas em monocamadas de células epiteliais culta convenientemente modelo ferida cura em vitro, que permita a para a imagem latente confocal ou microscopia de varredura a laser, e que pode proporcionar alta qualidade dados quantitativos e qualitativos para estudar tanto o comportamento da célula e os mecanismos envolvidos na migração.
Abstract
Migração celular é um aspecto obrigatório para cicatrização de feridas. Criação artificial feridas em modelos animais de pesquisa muitas vezes resulta em procedimentos experimentais caros e complicados, enquanto potencialmente carente de precisão. Cultura in vitro de linhas de células epiteliais fornece uma plataforma adequada para pesquisar o comportamento de células migratórias na cicatrização de feridas e o impacto de tratamentos nessas células. A fisiologia das células epiteliais é frequentemente estudada em condições não-confluente; no entanto, esta abordagem pode não se assemelham a ferida natural, condições de cura. Rompendo a integridade do epitélio por meios mecânicos, gera um modelo realista, mas pode impedir a aplicação de técnicas moleculares. Consequentemente, as técnicas de microscopia com base são ideais para estudar a migração de células epiteliais in vitro. Aqui nós detalhe dois métodos específicos, o ensaio de zero ferida artificial e o ensaio de migração artificial frontal, que pode obter dados quantitativos e qualitativos, respectivamente, sobre o desempenho migratório das células epiteliais.
Introduction
Migração celular é necessária para a cicatrização de feridas, como é responsável para o fechamento final do gap epitelial e restauração da superfície interrompidos1. Apresentando ferimentos artificiais em modelos animais permite a replicação deste complexo processo em perto de condições fisiológicas2. No entanto, esta abordagem muitas vezes resulta em procedimentos experimentais caros e complicados, que potencialmente carecem de precisão para o estudo de processos distintos, devido à natureza complexa do processo de cicatrização de feridas.
Cultura in vitro de linhas de células epiteliais fornece uma alternativa útil para modelos animais para pesquisar o papel que estas células desempenham na cicatrização de feridas e os efeitos do tratamento sobre comportamento migratório de célula. A fisiologia das células epiteliais geralmente é estudada por técnicas moleculares usando não confluente culturas3,4,5,6; no entanto, o rompimento da integridade do epitélio é geralmente conseguido incisões mecânicas fina. Em cultura de células, isto implica que o insignificante número de células pode ser exposto para a abertura da ferida, e representam uma amostra muito pequena para as técnicas de biologia molecular. No entanto, estas lesões podem ser estudadas em escala microscópica, aproveitando as propriedades migratórias inatas de algumas linhas de células epiteliais, tais como a célula epitelial de pulmão vison (Mv1Lu) ou a célula de queratinócitos humanos espontaneamente imortalizado (HaCaT) linhas.
Aqui nós descrevemos um método para a microscopia que é adequado para obter dados quantitativos sobre a migração de células epiteliais no contexto de3,4,7,8de cicatrização de feridas. Além disso, apresentamos métodos adicionais que são úteis para estudar mudanças qualitativamente moleculares e morfológicas que ocorrem em monocamadas epiteliais durante a migração. Em geral, esses métodos fornecem uma estrutura para estudar a dinâmica e a mudanças morfológicas envolvidas com comportamento de célula epitelial e resposta aos tratamentos durante a cicatrização de feridas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em cima da pele ou mucosa interrupção, função de barreira é restaurada pelas ações de numerosos tipos de células, incluindo fibroblastos ou células epiteliais e imunes. Em conjunto, estas células passam por um complexo processo envolvendo a apoptose, proliferação, diferenciação e importante, fibroblastos e epiteliais células migração, que é o derradeiro mecanismo responsável pela restauração do tecido interrompida e o encerramento do fosso epitelial superficial1,<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos dar graças aos membros mais velhos do laboratório que ajudam a melhorar e refinar essas técnicas ao seu estado real: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr. Catalina Ruiz-Cañada e Dr. Antonia Alcaraz-García. Estamos em dívida com o Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca para apoiar fortemente o desenvolvimento dessas técnicas. Também o Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Plano Estatal eu + D + I e o Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (n º de Grant: PI13/00794); www.ISCIII.es. reciclage FEDER “Una manera de hacer Europa”. Agradecemos também a Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca e FFIS para assistência e apoio administrativo. Finalmente, queremos dar um agradecimento especial ao Dr. Isabel Martínez-Argudo e a Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico de la Fábrica de Armas, a Universidad Castilla la Mancha, Toledo pelo apoio gentil em ceder de bom grado a Biomedicina e biotecnologia laboratório para tornar possível a filmada parte deste trabalho.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
| Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
| 24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
| Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
| Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
| 200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
| Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
| Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
| 10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
| Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
| Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
| Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |
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