Summary

Protocollo sperimentale per il rilevamento della funzione mitocondriale negli eparitociti esposti ai pesticidi organoclorina

Published: September 16, 2020
doi:

Summary

Comprendere l’influenza dei pesticidi organoclori ambientali (OC) sulla funzione mitocondriale negli epariti è importante per esplorare il meccanismo degli OC Che causano disturbi metabolici. Questo documento presenta metodi dettagliati per rilevare la funzione mitocondriale epatico.

Abstract

Questo documento presenta metodi dettagliati per rilevare la funzione mitocondriale epatico per comprendere meglio la causa dei disturbi metabolici causati dai pesticidi organoclori ambientali (OOC) negli epatociti. Le cellule di HepG2 sono state esposte β-hexachlorocyclohexane (β-HCH) per 24 h ad una dose equivalente di esposizione interna nella popolazione generale. L’ultrastruttura negli eparociti è stata esaminata dalla microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per mostrare il danno dei mitocondri. La funzione mitocondriale è stata ulteriormente valutata dall’intensità della fluorescenza mitocondriale, dai livelli di adenosina 5′-triphosphate (ATP), dal tasso di consumo di ossigeno (OCR) e dal potenziale della membrana mitocondriale (MMP) nelle cellule HepG2 incubate con β-HCH. L’intensità della fluorescenza dei mitocondri dopo essere stata osservata con una microscopia a fluorescenza verde mitocondriale è stata osservata con una microscopia a fluorescenza. La reazione luciferina-luciferasi è stata utilizzata per determinare i livelli ATP. L’MMP è stato rilevato dal colorante cationico JC-1 e analizzato sotto la citometria di flusso. L’OCR è stato misurato con un analizzatore di flusso extracellulare. In sintesi, questi protocolli sono stati utilizzati nel rilevamento della funzione mitocondriale negli eparitociti con per indagare sui danni dei mitocondri.

Introduction

Gli effetti dei pesticidi organoclori (OC) sulla salute, ad esempio l’interferenza riproduttiva, la tossicità immunologica, i cambiamenti metabolici sono stati precedentementestudiati 1,2,3. I metodi per rilevare il metabolismo cellulare e scoprire la disfunzione mitocondriale hanno permesso agli scienziati di comprendere il ruolo della funzionemitocondriale (cioè., livelli di STAT3 mitocondriale, lattato, piruvato, rapporto lattato-piruvate, coenzime Q10, perdita di protono mitocondriale, bioenergetica, biogenesi e dinamica) in aree come l’invecchiamento, l’obesità, il diabete, la funzione cardiovascolare, il cancro e la tossicità di sicurezza4,5,6,7. In questo articolo, descriviamo i metodi per valutare la disfunzione mitocondriale causata da OCP.

Abbiamo esposto le cellule DiPG2 a β-esachlorocyclohexane (β-HCH), un OCP rappresentativo, per 24 h ad una dose equivalente all’esposizione interna dell’uomo. In primo luogo, TEM è stato applicato per osservare l’ultrastruttura degli epariti, come nuclei, mitocondri e endoplasmice reticulum8. Rispetto ai normali microscopi, TEM consente di esplorare l’ultrastruttura 2D e 3D di cellule e componenti cellulari (linee cellulari o tessuti), la morfologia, la composizione chimica, nonché la funzione di materiali naturali o artificiali che svolgono un ruolo fondamentale nella scienza e nella tecnologia moderne. La funzione mitocondriale è stata ulteriormente valutata dall’intensità della fluorescenza mitocondriale, dai livelli di adenosina 5′-triphosphate (ATP), dal tasso di consumo di ossigeno (OCR) e dal potenziale di membrana mitocondriale (MMP)nelle cellule HepG2 incubate con β-HCH. Mito-tracker green è una sonda fluorescente verde mitocondri che può essere utilizzata per la colorazione fluorescente specifica mitocondriale a cellule vive. I mitocondri negli eparociti sono stati macchiati da soluzione verde mito-tracker e intensità di fluorescenza mitocondriale, numero e modello sono stati osservati con una microscopia confocale9. La sonda fluorescente verde mitocondriale può essere utilizzata per macchiare le cellule vive. Rispetto alla rodamina 123 o JC-1, la sonda fluorescente verde mitocondriale non dipende dal potenziale di membrana mitocondriale per la colorazione mitocondriale. I livelli di ATP sono stati determinati da un kit luciferasi-luciferina e normalizzati dalla concentrazione di proteine. Kit di analisi ATP può essere utilizzato per rilevare i livelli di ATP in soluzioni comuni, cellule o tessuti. Questo kit si basa sulla luciferasi luccilice catalizzato dalla fluoresina per generare fluorescenza, quando l’ATP è necessario per fornire energia. Quando la luccilice luciferasi e la fluoresina sono eccessive, in un certo intervallo di concentrazione, la generazione di fluorescenza è proporzionale alla concentrazione di ATP. Inoltre, questo kit è stato appositamente progettato per ottimizzare la chemiluminescenza di ATP. L’ATP, come le molecole energetiche più importanti, svolge un ruolo importante nei vari processi fisiologici o patologici delle cellule. I cambiamenti nei livelli ATP possono riflettere i difetti nella funzione cellulare, in particolare la produzione di energia mitocondriale. Di solito sotto apoptosi, necrosi o in qualche stato tossico, i livelli di ATP cellulare ridotto 10. Il kit di analisi MMPs con JC-1 è un kit che utilizza JC-1 come sonda fluorescente per rilevare cellule, tessuti o MMP purificati in modo rapido e sensibile. Può essere utilizzato per la diagnosi precoce di apoptosi. Il colorante cationico JC-1 è una sonda fluorescente utilizzata per rilevare l’MMP che può essere analizzata sotto la citometria di flusso indicata dai cambiamenti del rapporto di fluorescenza verde e rossa. Quando l’MMP è alto, JC-1 viene aggregato nella matrice dei mitocondri per formare un polimero (J-aggregati), che produce fluorescenza rossa. Quando l’MMP è basso, JC-1 non può accumularsi e forma monomero che produce fluorescenza verde11. Quindi il rapporto tra fluorescenza rossa e verde può riflettere il livello di MMP. L’OCR delle cellule è un indicatore cruciale della normale funzione cellulare12. È considerato come un parametro per la ricerca della funzione mitocondriale. Cell mito stress test kit fornisce un metodo stabile per l’analisi dei parametri chiave della funzione mitocondriale. Il kit fornisce il controllo di qualità e reagenti predittivi, nonché un metodo standard per l’esecuzione di test di stress mitocondriale cellulare. Può essere utilizzato per rilevare tutti i tipi di cellule, comprese le cellule primarie, linee cellulari, cellule sospese, e anche per isolotti, nematodi, lieviti e mitocondri isolati.

La misurazione OCR può fornire preziose informazioni sullo stato fisiologico o sulle alterazioni delle cellule. È stato determinato con un analizzatore di flusso extracellulare per rilevare la linea di base respiratoria, la perdita di protoni, il massimo respiratorio, il turnover ATP e la capacità di riserva. In breve, dopo le misurazioni di base di OCR, OCR è stato rilevato dopo l’aggiunta sequenziale a oligomicina (ATP Coupler), FCCP (fosforilazione ossidativa mitocondriale) per pozzo.

Nel tentativo di facilitare lo sviluppo di un protocollo più specifico per rilevare la funzione mitocondriale negli eparociti in vitro, presentiamo qui esperimenti di TEM, microscopia confocale, luminometro, citometria di flusso e analizzatore di flusso extracellulare con futura applicazione nello studio dei danni ai mitocondri relativi agli esiti avversi.

Protocol

Tutti gli esperimenti e i protocolli dell’esperimento sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti e approvati dal Comitato Etico locale dell’Università di Medicina di Nanjing. 1. Ultrastruttura mitocondriale di TEM Raccolta di celle HepG2 Seme Cellule HepG2 in piatti da 100 mm. Conservare a 37 gradi centigradi e 5% CO2. Digerire le cellule con 0,25% EDTA in tubo 1,5 mLEP. Centrifuga a 1000 x g per…

Representative Results

I mitocondri di cellule HepG2 esposte a β-HCH sono stati notevolmente danneggiati. I mitocondri sparsi erano leggermente espansi, di forma irregolare, e la cresta mitocondriale scomparve con un’architettura mitocondriale relativamente anormale (Figura 1). Intensità media di fluorescenza verde mitocondriale, che rappresenta i mitocondri, diminuita nelle cellule HepG2 esposte a β-HCH (<strong class…

Discussion

Fondamentale per il successo del protocollo di rilevamento è l’uso di una varietà di metodi sperimentali che sono stati trattati lo studio dal fenotipo al meccanismo. In questo studio, le cellule Dicale sono state colturate in DMEM con penicillina e streptomicina e siero bovino fetale al 10%. Quando le cellule hanno raggiunto il 40-50% di confluenza, β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) sono stati aggiunti e incubati per 24 h. In primo luogo abbiamo usato TEM che ha mostrato i cambiamenti ultrastrutturali nell’eparitocita causati…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 81573174, 81570574); l’Eccezionale Fondo Giovanile della Provincia di Jiangsu (SBK2014010296); il Progetto di Ricerca del Ministero dell’Istruzione cinese (213015A); il programma accademico prioritario sviluppo degli istituti di istruzione superiore Jiangsu (PAPD), il flagship major development degli istituti di istruzione superiore Jiangsu; e il Programma Open Project del Laboratorio Chiave di Stato di Chimica Ambientale ed Ecotossicologia (KF2015-01).

Materials

Transmission electron microscope  FEI Tecnai G2 Spirit Bio TWIN High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance
Mito-Tracker Green Beyotime C1048 Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining.
Laser scanning confocal microscope Zeiss 700B The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to  produce a perfect 3-dimensional specimen image.
Enhanced ATP Assay Kit Beyotime S0027 Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes.
Luminometer Berthold Centro LB 960 Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence.
BCA Protein Assay Kit Beyotime P0012 BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations.
Multimode reader TECAN InfiniteM200 Multimode reader be used to detect protein consentration.

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Cite This Article
Liu, Q., Jiang, Z., Gu, A. Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides. J. Vis. Exp. (163), e56800, doi:10.3791/56800 (2020).

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