有機塩素系農薬に曝露した肝細胞におけるミトコンドリア機能の検出実験プロトコル
Summary
肝細胞におけるミトコンドリア機能に対する環境有機塩素農薬(OP)の影響を理解することは、代謝障害を引き起こすOMPのメカニズムを探求する上で重要である。本論文では、肝ミトコンドリア機能の検出方法について詳しく説明する。
Abstract
本論文では、肝細胞における環境有機塩素農薬(OSP)による代謝障害の原因をより深く理解するための、肝ミトコンドリア機能の検出に関する詳細な方法を紹介する。ヘプG2細胞は、一般集団における内部曝露の等価用量で24時間のβ−ヘキサクロロシクロヘキサン(β-HCH)に曝露した。肝細胞における超構造を透過電子顕微鏡(TEM)で調べ、ミトコンドリアの損傷を示した。ミトコンドリア機能は、さらに、β-HCHでインキュベートされたHepG2細胞におけるミトコンドリア蛍光強度、アデノシン5′-三リン酸(ATP)レベル、酸素消費率(OCR)およびミトコンドリア膜電位(MMP)によって評価された。ミトコンドリア緑色蛍光プローブで染色後のミトコンドリア蛍光強度を蛍光顕微鏡で観察した。ルシフェリン-ルシメラーゼ反応を用い、ATPレベルを決定した。MMPを、カチオン色素JC-1によって検出し、フローサイトメトリー下で分析した。OCRは細胞外フラックス分析装置で測定した。要約すると、これらのプロトコルは、ミトコンドリアの損傷を調査するために肝細胞におけるミトコンドリア機能を検出するのに使用された。
Introduction
健康に対する有機塩素農薬(OMP)の影響、例えば生殖障害、免疫毒性、代謝変化は、以前に検討された1、2、3。2,3細胞代謝を検出し、ミトコンドリア機能障害を発見する方法は、科学者がミトコンドリア機能の役割を理解することを可能にしました (すなわち.、 ミトコンドリア STAT3レベル、 乳酸、 ピルビン酸、 乳酸とピルビン酸比、 コエンザイム Q10、 ミトコンドリア陽子漏れ、生体精エネルギー、生物発生、および動力学) 老化、肥満、糖尿病、心血管機能、癌、および安全毒性4,,55,6,,7.本論文では、オプスによるミトコンドリア機能障害の評価方法について述べている。
HepG2細胞をヒトの内部暴露に相当する用量で24時間の代表的なOCPであるβ-ヘキサクロロシクロヘキサン(β-HCH)に曝露した。まず、TEMを適用して、核、ミトコンドリア、小胞体8などの肝細胞の超構造を観察した。通常の顕微鏡と比較して、TEMは、細胞および細胞成分(細胞株または組織)の2Dおよび3D超構造、形態、化学組成、ならびに現代の科学技術において極めて重要な役割を果たす天然または人工材料の機能を探求することを可能にする。ミトコンドリア機能は、さらに、β-HCHでインキュベートされたHepG2細胞におけるミトコンドリア蛍光強度、アデノシン5′-三リン酸(ATP)レベル、酸素消費率(OCR)およびミトコンドリア膜電位(MMP)によって評価された。水戸トラッカーグリーンは、生細胞ミトコンドリア特異的蛍光染色に使用できるミトコンドリア緑色蛍光プローブです。肝細胞におけるミトコンドリアを、ミトトラッカーグリーン溶液とミトコンドリア蛍光強度で染色し、数とパターンを共焦点顕微鏡9で観察した。ミトコンドリア緑色蛍光プローブは、生細胞を染色するために使用することができる。ローダミン123またはJC-1と比較して、ミトコンドリア緑色蛍光プローブは、ミトコンドリア染色のミトコンドリア膜電位に依存しない。ATPレベルはルシファーゼ-ルシフェリンキットによって決定され、タンパク質濃度によって正規化された。ATPアッセイキットは、一般的な溶液、細胞または組織のATPレベルを検出するために使用することができます。このキットは、エネルギーを提供するためにATPが必要な場合、蛍光を生成するために蛍光を生成するために蛍光を触媒ホタルルシファーゼをベースにしています。ホタルルシメラーゼとフルオレセインが過剰である場合、ある濃度範囲では、蛍光の発生はATPの濃度に比例する。さらに、このキットはATPの化学発光を最大限に活用するために特別に設計されていた。ATPは、最も重要なエネルギー分子として、細胞の様々な生理学的または病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。ATPレベルの変化は、細胞機能、特にミトコンドリアエネルギー産生の欠陥を反映することができる。通常、アポトーシス下で、 壊死またはいくつかの毒性状態で, 細胞の ATP レベルは 10.JC-1のMMPアッセイキットは、細胞、組織、精製されたMMPを迅速かつ敏感に検出するための蛍光プローブとしてJC-1を使用するキットです。アポトーシスの早期発見に使用できます。カチオン色素JC-1は、緑と赤色の蛍光比の変化によって示されるフローサイトメトリー下で分析することができるMMPを検出するために使用される蛍光プローブです。MMPが高いとき、JC-1はミトコンドリアのマトリックスに凝集してポリマー(J-凝集体)を形成し、赤色蛍光を生じる。MMPが低いと、JC-1は蓄積できず、緑色蛍光11を生成する単量体を形成する。したがって、赤と緑の蛍光の比率は、MMPのレベルを反映することができます。細胞のOCRは、正常な細胞機能12の重要な指標である。ミトコンドリア機能を研究するためのパラメータとみなされます。細胞糸球菌ストレステストキットは、ミトコンドリア機能の主要パラメータを分析するための安定した方法を提供します。このキットは、細胞ミトコンドリアストレステストを行うための標準的な方法と同様に、品質管理と予測試薬を提供します。これは、すべての細胞タイプを検出するために使用することができます, プライマリ細胞を含みます, 細胞株, 浮遊細胞, また、小島, 線虫, 酵母と単離ミトコンドリア.
OCR測定は、細胞の生理的状態または変化に関する貴重な洞察を提供することができる。これは、呼吸ベースライン、陽子漏れ、最大呼吸、ATPターンオーバーおよび予備容量を検出するために細胞外フラックス分析装置で決定された。簡単に言えば、OCRのベースライン測定の後、OCRはオリゴマイシン(ATPカプラ)、FCCP(ミトコンドリア酸化リン酸化アンカプラー)および抗マイシンA/ロテノーネ(酸素消費の阻害剤)に順次添加した後に検出された。
インビトロでの肝細胞におけるミトコンドリア機能を検出するためのより具体的なプロトコルの開発を促進するために、ここでは、ミトコンドリアの損傷関連有害な結果を研究する際に、TEM、共焦点顕微鏡、ルミノメーター、フローサイトメトリーおよび細胞外フラックス分析による実験を提示する。
Protocol
Representative Results
Discussion
検出プロトコルの成功に不可欠なのは、表現型からメカニズムまで研究をカバーしてきた様々な実験方法の使用である。本研究では、ヘプG2細胞をペニシリンおよびストレプトマイシンおよび10%胎児ウシ血清でDMEMで培養した。細胞が合流率40~50%に達すると、β-HCH(0,10,100 ng/mL)を加え、24時間インキュベートした。代表のPPSによる肝細胞の超構造変化を示すTEMをまず用いたβ-HCHは、ミトコンドリ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は中国国立自然科学財団(グラント81573174、81570574)によって支援されました。江蘇省優秀青少年基金(SBK2014010296);中国教育省の研究プロジェクト(213015A);江蘇高等教育機関(PAPD)の優先的な学術プログラム開発、江蘇高等教育機関の主力主要な発展;環境化学・環境毒性学の国家キー研究所のオープンプロジェクトプログラム(KF2015-01)。
Materials
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit Bio TWIN | High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance |
| Mito-Tracker Green | Beyotime | C1048 | Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining. |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 700B | The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to produce a perfect 3-dimensional specimen image. |
| Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 | Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes. |
| Luminometer | Berthold | Centro LB 960 | Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence. |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0012 | BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations. |
| Multimode reader | TECAN | InfiniteM200 | Multimode reader be used to detect protein consentration. |
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