Protocolo Experimental para Detecção de Função Mitocondrial em Hepatócitos Expostos a Pesticidas Organoclorine

Summary

Compreender a influência dos pesticidas organocloritos ambientais (OCPs) na função mitocondrial nos hepatócitos é importante na exploração do mecanismo de OCPs causando distúrbios metabólicos. Este artigo apresenta métodos detalhados na detecção da função mitôndrial hepática.

Abstract

Este artigo apresenta métodos detalhados na detecção da função mitôndrial hepática para uma melhor compreensão da causa de distúrbios metabólicos causados por pesticidas organocrono ambiental (OCPs) em hepatócitos. As células hepG2 foram expostas a β-hexacloocyclohexane (β-HCH) por 24 h em uma dose equivalente de exposição interna na população geral. A ultraestrutura nos hepatócitos foi examinada por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para mostrar o dano das mitocôndrias. A função mitocondrial foi ainda avaliada pela intensidade da fluorescência mitocondrial, níveis de adenosina de 5′-triphosphate (ATP), taxa de consumo de oxigênio (OCR) e potencial de membrana mitocondrial (MMP) em células HepG2 incubadas com β-HCH. A intensidade da fluorescência mitocondria após manchada pela sonda fluorescente verde mitocondrial foi observada com uma microscopia de fluorescência. A reação luciferina-luciferase foi usada para determinar os níveis de ATP. O MMP foi detectado pelo corante cationic JC-1 e analisado sob citometria de fluxo. OCR foi medido com um analisador de fluxo extracelular. Em resumo, esses protocolos foram utilizados na detecção da função mitocondrial em hepatócitos para investigar danos mitocôndrias.

Introduction

Os efeitos dos pesticidas organocloritos (OCPs) na saúde, por exemplo, interferência reprodutiva, toxicidade imunológica, alterações metabólicas foram previamente estudados^1,,2,3. Os métodos para detectar o metabolismo celular e descobrir a disfunção mitocondrial permitiram que os cientistas entendessem o papel da função mitocondrial (ou seja., níveis mitocondrial STAT3, lactato, piruvato, razão lactato-piruvato, coenzima Q10, vazamento de prótons mitocondrial, bioenergetics, biogênese e dinâmica) em áreas como envelhecimento, obesidade, diabetes, função cardiovascular, câncer e toxicidade de segurança^4,,5,,6,7. Neste artigo, descrevemos os métodos de avaliação da disfunção mitocondrial causada pelos OCPs.

Expusemos células HepG2 a β-hexacloocyclohexane (β-HCH), um OCPs representativo, por 24 h em uma dose equivalente à exposição interna do ser humano. Em primeiro lugar, foi aplicado o TEM para observar a ultraestrutura de hepatócitos, como núcleos, mitocôndrias e regúlum⁸endoplasmáticos . Em comparação com microscópios comuns, o TEM permite explorar a ultraestrutura 2D e 3D de células e componentes celulares (linhas celulares ou tecidos), a morfologia, a composição química, bem como a função de materiais naturais ou artificiais que desempenham um papel fundamental na ciência e tecnologia modernas. A função mitocondrial foi ainda avaliada pela intensidade da fluorescência mitocondrial, níveis de adenosina de 5′-triphosphate (ATP), taxa de consumo de oxigênio (OCR) e potencial de membrana mitocondrial (MMP) em células HepG2 incubadas com β-HCH. Mito-tracker green é uma sonda fluorescente verde mitocôndria que pode ser usada para coloração fluorescente específica de células vivas. As mitocôndrias em hepatócitos foram manchadas pela solução verde mito-tracker e a intensidade, número e padrão mitocondrial foram observados com uma microscopia confocal⁹. Sonda fluorescente verde mitocondrial pode ser usada para manchar células vivas. Em comparação com a rhodamina 123 ou JC-1, a sonda fluorescente verde mitocondrial não depende do potencial de membrana mitocondrial para coloração mitocondrial. Os níveis de ATP foram determinados por um kit de luciferase-luciferina e normalizados pela concentração proteica. O kit de ensaios ATP pode ser usado para detectar níveis de ATP em soluções, células ou tecidos comuns. Este kit é baseado em luciferase de vagalume catalisada por fluoresceína para gerar fluorescência, quando a ATP é necessária para fornecer energia. Quando a luciferase de vagalume e fluoresceína são excessivas, em uma certa faixa de concentração, a geração de fluorescência é proporcional à concentração de ATP. Além disso, este kit foi especialmente projetado para otimizar a chemiluminescence da ATP. A ATP, como as moléculas de energia mais importantes, desempenha um papel importante nos diversos processos fisiológicos ou patológicos das células. Mudanças nos níveis de ATP podem refletir defeitos na função celular, especialmente na produção de energia mitocondrial. Normalmente sob apoptose, necrose ou em algum estado tóxico, os níveis de ATP celular reduziram ¹⁰. O kit de ensaio mmps com JC-1 é um kit que usa JC-1 como uma sonda fluorescente para detectar células, tecidos ou MMPs purificados de forma rápida e sensível. Pode ser usado para detecção precoce de apoptose. O corante cácional JC-1 é uma sonda fluorescente usada para detectar o MMP que pode ser analisado sob citometria de fluxo indicada por alterações na razão de fluorescência verde e vermelha. Quando o MMP é alto, o JC-1 é agregado na matriz das mitocôndrias para formar um polímero (J-agregados), que produz fluorescência vermelha. Quando o MMP é baixo, o JC-1 não consegue acumular e forma monômero que produz fluorescência verde¹¹. Assim, a razão de fluorescência vermelha e verde pode refletir o nível de MMP. O OCR das células é um indicador crucial da função celular normal¹². É considerado como um parâmetro para pesquisar a função mitocondrial. O kit de teste de estresse mito celular fornece um método estável para analisar parâmetros-chave da função mitocondrial. O kit fornece controle de qualidade e reagentes preditivos, bem como um método padrão para a realização de teste de estresse mitocondrial celular. Pode ser usado para detectar todos os tipos de células, incluindo células primárias, linhas celulares, células suspensas, e também para ilhotas, nematoides, leveduras e mitocôndrias isoladas.

A medição do OCR pode fornecer uma visão valiosa do estado fisiológico ou alterações das células. Foi determinado com um analisador de fluxo extracelular para detectar a linha de base respiratória, vazamento de prótons, respiratório máximo, rotatividade de ATP e capacidade de reserva. Em suma, após medições de linha de base do OCR, o OCR foi detectado após adicionar sequencialmente à oligomicina (ATP Coupler), FCCP (fosforilação oxidativa mitocondrial uncoupler) e antimicina A/rotenona (um inibidor do consumo de oxigênio)por poço.

Em um esforço para facilitar o desenvolvimento de protocolos mais específicos para a detecção da função mitocondrial em hepatócitos in vitro, apresentamos aqui experimentos de TEM, microscopia confocal, luminômetro, citometria de fluxo e analisador de fluxo extracelular com aplicação futura no estudo de desfechos adversos relacionados a danos mitocôndrias.

Protocol

Todos os experimentos e os protocolos de experimento foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes e aprovados pelo Comitê de Ética local da Universidade Médica de Nanjing. 1. Ultraestrutura mitocondrial por TEM Coleta de células HepG2 Células Seed HepG2 em pratos de 100 mm. Armazenar a 37 °C e 5% de CO2. Digestão de células com 0,25% EDTA em tubo de 1,5 mLEP. Centrifugar a 1000 x g por 3 min a tempera…

Representative Results

As mitocôndrias cristae de células HepG2 expostas a β-HCH foram marcadamente danificadas. Mitocôndrias dispersas foram levemente expandidas, de forma irregular e cume mitocondrial desaparecido com arquitetura mitocondrial relativamente anormal(Figura 1). A intensidade média da fluorescência verde mitocondrial, que representa as mitocôndrias, diminuiu nas células HepG2 expostas ao β-HCH<stro…

Discussion

Fundamental para o sucesso do protocolo de detecção é o uso de uma variedade de métodos experimentais que foram cobertos do estudo do fenótipo ao mecanismo. Neste estudo, as células HepG2 foram cultivadas em DMEM com penicilina e estreptomicina e 10% de soro bovino fetal. Quando as células atingiram 40-50% de confluência, β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) foram adicionadas e incubadas por 24 h. Em primeiro lugar, utilizamos o TEM que mostrou as alterações ultraestruturais no hepatocito causados pelos OCPs representativ…

Materials

Transmission electron microscope	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance
Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining.
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	700B	The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to  produce a perfect 3-dimensional specimen image.
Enhanced ATP Assay Kit	Beyotime	S0027	Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes.
Luminometer	Berthold	Centro LB 960	Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence.
BCA Protein Assay Kit	Beyotime	P0012	BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations.
Multimode reader	TECAN	InfiniteM200	Multimode reader be used to detect protein consentration.