Met behulp van fluorescentie In Situ hybridisatie (FISH) te controleren van de toestand van Arm cohesie in Prometaphase en metafase ik Drosophila eicellen
Summary
Dit manuscript presenteert een gedetailleerde methode voor het genereren van X-chromosoom arm sondes en presterende fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) te onderzoeken van de Braziliaanse deelstaat zus chromatide cohesie in prometaphase en metafase ik gearresteerd Drosophila eicellen. Dit protocol is geschikt om te bepalen of cohesie Meiotische arm intact of verstoord in verschillende genotypen is.
Abstract
Bij de mens zijn chromosoom segregatie fouten in eicellen verantwoordelijk voor de meeste miskramen en aangeboren afwijkingen. Bovendien, als vrouwen ouder, staat hun risico van concipiëren dat een aneuploid foetus stijgt dramatisch en dit verschijnsel bekend als de maternale leeftijd effect. Een van de vereisten voor nauwkeurige chromosoom segregatie tijdens de Meiotische divisies is onderhoud van zuster chromatide cohesie in de uitgebreide profase periode dat eicellen ervaring. Cytologische aanwijzingen bij zowel mensen als modelorganismen dat Meiotische cohesie tijdens het verouderingsproces verslechtert. Daarnaast segregatie fouten in menselijke eicellen zijn meest voorkomende tijdens de meiose I, consistent met de voortijdige verlies van samenhang van de arm. Het gebruik van modelorganismen is essentieel voor het ontrafelen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de leeftijd afhankelijk verlies van samenhang. Drosophila melanogaster biedt verschillende voordelen voor het bestuderen van de verordening van Meiotische samenhang in de eicellen. Echter tot voor kort waren alleen genetische tests beschikbaar voor assay voor het verlies van samenhang van de arm in eicellen van verschillende genotypen of onder verschillende experimentele omstandigheden. Hier is een gedetailleerde protocol is voorwaarde voor het gebruik van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) direct visualiseren gebreken in arm cohesie in prometaphase ik en metafase ik gearresteerd Drosophila eicellen. Door het genereren van een sonde van de vis die hybridizes op de distale arm van het X -chromosoom en het verzamelen van de confocal Z stapels, een onderzoeker kan visualiseren het aantal individuele vis signalen in drie dimensies en bepalen of zuster chromatide armen zijn gescheiden. De procedure maakt het mogelijk te kwantificeren arm cohesie gebreken in honderden Drosophila eicellen. Deze methode is als zodanig een belangrijk instrument voor het onderzoeken van de mechanismen die bijdragen tot cohesie onderhoud, alsmede de factoren die tot zijn nalating tijdens het verouderingsproces leiden.
Introduction
Juiste segregatie van chromosomen tijdens de mitose en meiose vereist dat zuster chromatide cohesie worden vastgesteld, onderhouden en uitgebracht in een gecoördineerde wijze1,2. Cohesie is opgericht tijdens de S-fase en is bemiddeld door het cohesin complex, die vormen van fysieke verbanden die houden van de zuster chromatiden samen. In meiose, cohesie distale naar een crossover ook functies om recombinante homologen bij elkaar te houden en deze fysieke vereniging helpt ervoor te zorgen de juiste stand van het tweewaardig op de metafase ik spindel (Figuur 1)3,4, 5. Release van arm samenhang op anafase ik kunt het homologen te scheiden naar tegenovergestelde Polen van de spindel. Als echter arm cohesie is voortijdig, verloren recombinante homologen zal verliezen hun fysieke verbinding en scheiden willekeurig, hetgeen kan leiden tot aneuploid gameten (Figuur 1).
In menselijke eicellen, fouten in chromosoom segregatie zijn de belangrijkste oorzaak van miskramen en aangeboren afwijkingen, zoals Down syndroom6, en de frequentie ervan exponentieel toeneemt met maternale leeftijd7. Zuster chromatide cohesie is opgericht in de foetale oöcyten en Meiotische recombinatie is voltooid vóór de geboorte. Eicellen dan arresteren in Mid profase ik tot ovulatie en tijdens deze arrestatie, de aanhoudende fysieke vereniging van recombinante homologen afhankelijk van zuster chromatide cohesie. Daarom vereisen nauwkeurige segregatie tijdens meiose en normale zwangerschap resultaten dat cohesie voor maximaal vijf decennia intact blijven.
Voortijdige verlies van samenhang tijdens de langdurige Meiotische arrestatie van menselijke eicellen heeft voorgesteld om bij te dragen aan het effect van de maternale leeftijd en meerdere tekstregels bewijs ondersteunen deze hypothese8,9. Echter, gezien de uitdagingen van het bestuderen van Meiotische cohesie in menselijke eicellen, veel van ons begrip van dit verschijnsel is afhankelijk van het gebruik van model organismen5,10,11,12, 13,14,15.
Drosophila melanogaster eicellen bieden tal van voordelen voor de studie van Meiotische cohesie en chromosoom segregatie. Een eenvoudige genetische bepaling maakt het mogelijk om te herstellen van de nakomelingen van aneuploid gameten en meten van de betrouwbaarheid van X-chromosoom segregatie op een grote schaal11,16,17. Bovendien kan men ook bepalen of chromosoom segregatie fouten ontstaan omdat de recombinante homologen missegregate tijdens de meiose I, een fenotype die strookt met de voortijdige verlies van arm cohesie11,18, 19. Directe observatie van de Braziliaanse deelstaat Meiotische cohesie in Drosophila eicellen is ook mogelijk met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). Hoewel fluorescerende oligonucleotides die aan repetitieve satelliet sequenties kruisen zijn gebruikt voor meer dan een decennium te controleren pericentromeric cohesie in volwassen Drosophila eicellen4,20, analyse van de arm cohesie is veel uitdagender. Visualisatie van de toestand van arm cohesie vereist een sonde die een groot gebied van één exemplaar beslaat sequenties en is helder genoeg om te resulteren in zichtbare signalen voor individuele zuster chromatiden wanneer arm cohesie afwezig is. Bovendien, moeten de oöcyt fixatie voorwaarden en de grootte van de gelabelde Ani vergemakkelijken penetratie21 in de grote volwassen Drosophila oöcyt (200 µm breed door 500 µm lang). Onlangs, een arm sonde werd met succes gebruikt om te visualiseren van Drosophila oöcyt chromatiden tijdens anafase ik, maar de auteurs verklaard dat zij niet een signaal in prometaphase detecteren kon of metafase ik eicellen22gearresteerd. Hier voorzien wij een gedetailleerd protocol voor de generatie van de X-chromosoom arm vis sondes en oöcyt voorbereiding voorwaarden die hebben ons toegelaten om te assay voor het voortijdige verlies van zuster chromatide cohesie in prometaphase ik en metafase ik eicellen. Deze technieken, waardoor ons te identificeren genproducten die vereist voor het behoud van Meiotische cohesie zijn, zal toestaan dat anderen te assay voor zuster chromatide cohesie gebreken in volwassen Drosophila eicellen van verschillende genotypen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gebruik van vis sondes te beoordelen van de toestand van arm cohesie in prometaphase ik en metafase ik Drosophila eicellen is een aanzienlijke vooruitgang op het gebied van Drosophila meiose. Historisch, zijn Drosophila onderzoekers beperkt tot genetische tests afleiden van voortijdige verlies van samenhang van de arm in de rijpe eicellen11,18,19. Nu, met de methoden die hier gepresenteerd, de toes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de NIH Grant GM59354 toegekend aan Sharon E. Bickel. Wij danken Huy Q. Nguyen voor hulp bij de ontwikkeling van het protocol voor het genereren van fluorescerende arm sondes, Ann Lavanway voor hulp bij confocale microscopie, en J. Emiliano Reed voor technische bijstand. Wij danken ook talrijke collega’s in de Gemeenschap van de Drosophila voor nuttige discussies en advies.
Materials
| Kits | |||
| Midi Prep kit | Qiagen | 12143 | Prep BAC clone DNA |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2 | Amplify BAC clone DNA |
| ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit | Invitrogen | A21676 | Label BAC clone DNA |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals & Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | Prepare 10% stock Freeze aliquots |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C75-500 | |
| DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use. |
| Dextran sulfate | Sigma | D-8906 | |
| Drierite | Drierite Company | 23001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 15508-013 | Prepare 10 mM stock |
| dTTP (10 µmol, 100 µl) | Boehringer Mannheim | 1277049 | Prepare 1 mM stock |
| EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) | Fisher Scientific | S311-500 | Prepare 250 mM stock |
| 100% ethanol (molecular grade, 200 proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Tris (Ultra Pure) | Invitrogen | 15504-020 | |
| EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) | Sigma | E-3889 | |
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | Toxic: wear appropriate protection |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | Toxic: wear appropriate protection |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Glycogen | Roche | 901393 | |
| HEPES | Boehringer Mannheim | 737-151 | |
| Heptane | Fisher Scientific | H350-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydrochloric acid | Millipore | HX0603-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydroxylamine | Sigma | 438227 | Prepare 3 M stock |
| 4.9 M Magnesium chloride | Sigma | 104-20 | |
| Na2HPO4 Ÿ 7H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaH2PO4 Ÿ 2H2O | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Poly-L-lysine (0.1mg/ml) | Sigma | P8920-100 | |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
| Sodium acetate | Fisher Scientific | S209-500 | Prepare 3M stock |
| Sodium cacodylate | Polysciences, Inc. | 1131 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Sodium chloride |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| 10% Tween 20 | Thermo Scientific | 28320 | Surfact-Amps |
| 10% Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | Surfact-Amps |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0 | ||
| 20X SSC (Saline Sodium Citrate) | 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate | ||
| 2X cacodylate fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA | ||
| 1.1X Hybridization buffer | 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate | ||
| Fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution | ||
| PBSBTx | 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100 | ||
| PBSTx | 1X PBS, 1% Trition X-100 | ||
| Extraction buffer (PBSTx + Rnase) | 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase | ||
| 2X SSCT | 2X SSC, 0.1% Tween 20 | ||
| 2X SSCT + 20% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide | ||
| 2X SSCT + 40% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide | ||
| 2X SSCT + 50% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| AluI | New England Biolabs | R0137S | |
| HaeIII | New England Biolabs | R0108S | |
| MseI | New England Biolabs | R0525S | |
| MspI | New England Biolabs | R0106S | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167S | |
| BfuCI | New England Biolabs | R0636S | |
| 100X BSA | New England Biolabs | Comes with NEB enzymes | |
| 10X NEB buffer #2 | New England Biolabs | Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes | |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl | Roche/Sigma | 3333566001 | |
| TdT buffer | Roche/Sigma | Comes with TdT enzyme | |
| Cobalt chloride | Roche/Sigma | Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme | |
| RNase A (10 mg/mL) | Thermo-Scientific | EN0531 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytology Tools etc. | |||
| Forceps | Dumont | #5 INOX, Biologie | |
| 9” Disposable glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | Autoclave to sterilize |
| Shallow glass dissecting dish | Custom made | ||
| Deep well dish (3 wells) | Pyrex | 7223-34 | |
| Fisherfinest Premium microscope slides | Fisher Scientific | 22-038-104 | Used to cover deep well dishes |
| Frosted glass slides, 25 x 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick | Thermo-Scientific | 3051 | |
| Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 | Thermo-Scientific | 3405 | |
| Tungsten needle | homemade | ||
| Prolong GOLD mounting media | Molecular Probes | P36930 | |
| Compressed-air in can | Various | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Various | ||
| Nanodrop 2000, spectrophotometer | Thermo-Scientific | microvolume spectrophotometer | |
| Vortexer | Various | ||
| Table top microfuge at room temperature | Various | ||
| Table top microfuge at 4 °C | Various | ||
| Heat block | Various | ||
| Hybridization oven or incubator with rotator | Various | ||
| Nutator | Various | ||
| A1RSi laser scanning confoal | Nikon | 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables etc. | |||
| 50 mL conical tubes | Various | ||
| 15 mL conical tubes | Various | ||
| 1.5 mL microfuge tubes | Various | ||
| 500 µl microfuge tubes | Various | ||
| 200 µl PCR tubes | Various | ||
| Plastic container with tight fitting lid | Various | To hold Drierite | |
| Kimwipes | Various | disposable wipes | |
| Parafilm | Various | paraffin film | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other | |||
| HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | Version 6.3 |
References
- Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
- Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
- Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
- Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
- Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
- Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).
- Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
- Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
- Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
- Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
- Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
- Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. Genetics. 181, 1207-1218 (2009).
- Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
- Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).
- Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
- Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
- Dernburg, A. F., Sedat, J. W. . Method Cell Biol. 53, 187-233 (1998).
- Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
- Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).
- Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).
- Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
- Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
- Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).
