Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) verwenden, um den Zustand der Arm Zusammenhalt im Prometaphase und Metaphase überwachen ich Drosophila Eizellen
Summary
Dieses Manuskript stellt eine detaillierte Methode zur Erzeugung von X-Chromosom Arm Sonden und darstellende Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) zu prüfen, den Zustand der Schwester Chromatids Zusammenhalt im prometaphase und Metaphase ich verhaftet Drosophila Eizellen. Dieses Protokoll eignet sich zur Feststellung, ob meiotische Arm Zusammenhalt intakt oder in verschiedenen Genotypen gestört ist.
Abstract
Beim Menschen sind Chromosom Abtrennung Fehler in Eizellen verantwortlich für die meisten Fehlschläge und Geburtsschäden. Außerdem ist, wie Frauen im Alter, ist ihr Risiko zu konzipieren, dass eine Aneuploidie Fötus drastisch erhöht und dieses Phänomen als mütterliches Alter-Effekt bekannt. Eine Voraussetzung für präzise Chromosom Trennung während der meiotischen Divisionen sind Wartung der Schwester Chromatids Zusammenhalt in der erweiterten Prophase-Zeit, die Eizellen zu erleben. Zytologische Nachweis bei Menschen und Modellorganismen zufolge meiotische Zusammenhalt während der Alterungsprozess verschlechtert sich. Darüber hinaus Segregation Fehler in der menschlichen Eizellen sind am häufigsten während der Meiose I, Einklang mit vorzeitigen Verlust der Arm Zusammenhalt. Die Verwendung von Modellorganismen ist entscheidend für die Entschlüsselung der Mechanismen, die altersabhängigen Verlust der Kohäsion zugrunde liegen. Drosophila Melanogaster bietet mehrere Vorteile für die Regulierung der meiotischen Zusammenhalt in Eizellen zu studieren. Allerdings waren bis vor kurzem nur genetische Tests zur Verfügung, um für den Verlust von Arm Zusammenhalt in Eizellen von unterschiedlichen Genotypen oder unter verschiedenen experimentellen Bedingungen bestimmen. Hier ist ein detailliertes Protokoll, unter der Voraussetzung für die Verwendung von Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) direkt zu visualisieren Mängel an Arm Zusammenhalt im prometaphase ich und Metaphase ich Drosophila Eizellen verhaftet. Erzeugen eine Fisch-Sonde, die am distalen Arm des x-Chromosoms hybridisiert und konfokale Z-Stapel zu sammeln, kann Forscher die Anzahl der einzelnen Fische Signale in drei Dimensionen zu visualisieren und festzustellen, ob Schwester Chromatids Arme sind getrennt. Das beschriebene Verfahren ermöglicht es, Arm Zusammenhalt Mängel in Hunderten von Drosophila Eizellen zu quantifizieren. Als solches stellt diese Methode ein wichtiges Instrument für die Untersuchung der Mechanismen, die zum Zusammenhalt Wartung sowie die Faktoren, die zu seinem Untergang, während der Alterungsprozess führen beitragen.
Introduction
Angemessene Trennung der Chromosomen während der Mitose und Meiose erfordert, dass Schwester Chromatids Zusammenhalt werden eingerichtet, gepflegt und veröffentlicht in koordinierter Form1,2. Zusammenhalt ist in S Phase etabliert und wird durch die Cohesin komplexe, die physischen Verbindungen bildet, die die Schwester halten vermittelt Chromatiden zusammen. In Meiose, Zusammenhalt distal zu einer Überschneidung auch Funktionen zum rekombinanten homologe zusammen zu halten und diese körperliche Vereinigung gewährleistet korrekte Ausrichtung der Bivalent auf der Metaphase ich Spindel (Abbildung 1)3,4, 5. Freisetzung von Arm Zusammenhalt auf Anaphase ich ermöglicht die homologe zu den entgegengesetzten Polen der Spindel zu trennen. Jedoch wenn Arm Zusammenhalt ist verloren vorzeitig, rekombinante homologe verlieren ihre physische Verbindung und zufällig, zu trennen, was aneuploiden Keimzellen (Abbildung 1) führen kann.
In der menschlichen Eizellen Fehler im Chromosom Trennung sind die häufigste Ursache für Fehlschläge und Geburtsschäden, wie z. B. Down-Syndrom-6, und ihre Häufigkeit steigt exponentiell mit der mütterlichen Alter7. Schwester Chromatids Zusammenhalt entsteht in der fetalen Eizellen und meiotischen Rekombination erfolgt vor der Geburt. Eizellen dann verhaften in Mitte Prophase ich bis zum Eisprung und während dieser Festnahme, die weiterhin körperliche Vereinigung der rekombinanten homologe setzt auf Schwester Chromatids Zusammenhalt. Daher genaue Trennung während der Meiose und normale Schwangerschaft Ergebnisse erfordern, dass Zusammenhalt für bis zu fünf Jahrzehnte intakt bleiben.
Vorzeitiger Verlust der Zusammenhalt während der verlängerten meiotische Festnahme von menschlichen Eizellen zu der mütterlichen Alter Wirkung beitragen soll und mehrere Textzeilen Beweise unterstützen diese Hypothese8,9. Jedoch angesichts der Herausforderungen des Studiums meiotische Zusammenhalt in der menschlichen Eizellen, viel von unserem Verständnis für dieses Phänomen beruht auf der Verwendung von Modell Organismen5,10,11,12, 13,14,15.
Drosophila Melanogaster Eizellen bieten zahlreiche Vorteile für die Studie der meiotischen Zusammenhalt und Chromosom Segregation. Eine einfache genetische Test erlaubt es, Nachkommen von aneuploiden Keimzellen erholen und messen die Treue des X-Chromosom Segregation auf einer großen Skala11,16,17. Darüber hinaus kann man auch bestimmen, ob Chromosom Abtrennung Fehler entstehen, weil rekombinante homologe missegregate während der Meiose I, einem Phänotyp, der vorzeitige Verlust der Arm Zusammenhalt11,18, entspricht 19. direkte Beobachtung des Bundesstaates meiotische Zusammenhalt in Drosophila Eizellen ist auch möglich mit Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH). Obwohl fluoreszierende Oligonukleotiden, die sich wiederholende Sat-Sequenzen hybridisieren wurden für mehr als ein Jahrzehnt zur Chromosomenregion Zusammenhalt in Reife Drosophila Eizellen4,20, Analyse der Arm überwachen Zusammenhalt ist viel schwieriger gewesen. Visualisierung des Bundesstaates Arm Zusammenhalt erfordert eine Sonde, die ein großes Gebiet der Urschrift umfasst Sequenzen und ist hell genug, um sichtbare Signale für einzelne Schwester Chromatiden entstehen, wenn Arm Zusammenhalt fehlt. Darüber hinaus müssen die Eizelle Fixierung Bedingungen und Größe der beschrifteten DNA eindringen21 in der großen Reifen Drosophila Eizelle (200 µm Breite von 500 µm lang) erleichtern. Vor kurzem wurde eine Arm-Sonde erfolgreich genutzt, Drosophila Eizelle Chromatiden während Anaphase zu visualisieren, ich, aber die Autoren erklärt, dass sie nicht ein Signal im prometaphase erkennen könnte oder Metaphase ich verhaftet Eizellen22. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Generation von X-Chromosom Arm FISH-Sonden und Eizelle Herstellungsbedingungen, die uns für den vorzeitigen Verlust der Schwester Chromatids Zusammenhalt im prometaphase assay ich und Metaphase erlaubt haben, ich Eizellen. Diese Techniken, die es uns ermöglicht haben, Genprodukte zu identifizieren, die für die Aufrechterhaltung der meiotischen Zusammenhalt erforderlich sind, damit andere assay für Schwester Chromatids Zusammenhalt Mängel an Reifen Drosophila Eizellen der verschiedenen Genotypen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Verwendung von Fisch-Sonden zur Bewertung des Zustands der Arm Zusammenhalt im prometaphase ich und Metaphase ich Drosophila Eizellen ist eine deutliche Weiterentwicklung im Bereich der Drosophila Meiose. In der Vergangenheit wurden Drosophila Forscher zu Gentests zu vorzeitigen Verlust der Arm Zusammenhalt in reifen Eizellen11,18,19folgern beschränkt. Nun kann mit der hier vorgestellten Methoden …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von NIH Grant GM59354 an Sharon E. Bickel vergeben unterstützt. Wir danken für die Unterstützung bei der Ausarbeitung des Protokolls für die Erzeugung von fluoreszierenden Arm Sonden, Ann Lavanway Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie und J. Emiliano Reed für technische Hilfe Huy Nguyen q. Wir danken auch zahlreiche Kolleginnen und Kollegen in der Drosophila-Community für hilfreiche Gespräche und Beratung.
Materials
| Kits | |||
| Midi Prep kit | Qiagen | 12143 | Prep BAC clone DNA |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2 | Amplify BAC clone DNA |
| ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit | Invitrogen | A21676 | Label BAC clone DNA |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals & Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | Prepare 10% stock Freeze aliquots |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C75-500 | |
| DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use. |
| Dextran sulfate | Sigma | D-8906 | |
| Drierite | Drierite Company | 23001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 15508-013 | Prepare 10 mM stock |
| dTTP (10 µmol, 100 µl) | Boehringer Mannheim | 1277049 | Prepare 1 mM stock |
| EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) | Fisher Scientific | S311-500 | Prepare 250 mM stock |
| 100% ethanol (molecular grade, 200 proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Tris (Ultra Pure) | Invitrogen | 15504-020 | |
| EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) | Sigma | E-3889 | |
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | Toxic: wear appropriate protection |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | Toxic: wear appropriate protection |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Glycogen | Roche | 901393 | |
| HEPES | Boehringer Mannheim | 737-151 | |
| Heptane | Fisher Scientific | H350-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydrochloric acid | Millipore | HX0603-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydroxylamine | Sigma | 438227 | Prepare 3 M stock |
| 4.9 M Magnesium chloride | Sigma | 104-20 | |
| Na2HPO4 Ÿ 7H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaH2PO4 Ÿ 2H2O | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Poly-L-lysine (0.1mg/ml) | Sigma | P8920-100 | |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
| Sodium acetate | Fisher Scientific | S209-500 | Prepare 3M stock |
| Sodium cacodylate | Polysciences, Inc. | 1131 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Sodium chloride |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| 10% Tween 20 | Thermo Scientific | 28320 | Surfact-Amps |
| 10% Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | Surfact-Amps |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0 | ||
| 20X SSC (Saline Sodium Citrate) | 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate | ||
| 2X cacodylate fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA | ||
| 1.1X Hybridization buffer | 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate | ||
| Fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution | ||
| PBSBTx | 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100 | ||
| PBSTx | 1X PBS, 1% Trition X-100 | ||
| Extraction buffer (PBSTx + Rnase) | 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase | ||
| 2X SSCT | 2X SSC, 0.1% Tween 20 | ||
| 2X SSCT + 20% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide | ||
| 2X SSCT + 40% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide | ||
| 2X SSCT + 50% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| AluI | New England Biolabs | R0137S | |
| HaeIII | New England Biolabs | R0108S | |
| MseI | New England Biolabs | R0525S | |
| MspI | New England Biolabs | R0106S | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167S | |
| BfuCI | New England Biolabs | R0636S | |
| 100X BSA | New England Biolabs | Comes with NEB enzymes | |
| 10X NEB buffer #2 | New England Biolabs | Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes | |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl | Roche/Sigma | 3333566001 | |
| TdT buffer | Roche/Sigma | Comes with TdT enzyme | |
| Cobalt chloride | Roche/Sigma | Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme | |
| RNase A (10 mg/mL) | Thermo-Scientific | EN0531 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytology Tools etc. | |||
| Forceps | Dumont | #5 INOX, Biologie | |
| 9” Disposable glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | Autoclave to sterilize |
| Shallow glass dissecting dish | Custom made | ||
| Deep well dish (3 wells) | Pyrex | 7223-34 | |
| Fisherfinest Premium microscope slides | Fisher Scientific | 22-038-104 | Used to cover deep well dishes |
| Frosted glass slides, 25 x 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick | Thermo-Scientific | 3051 | |
| Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 | Thermo-Scientific | 3405 | |
| Tungsten needle | homemade | ||
| Prolong GOLD mounting media | Molecular Probes | P36930 | |
| Compressed-air in can | Various | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Various | ||
| Nanodrop 2000, spectrophotometer | Thermo-Scientific | microvolume spectrophotometer | |
| Vortexer | Various | ||
| Table top microfuge at room temperature | Various | ||
| Table top microfuge at 4 °C | Various | ||
| Heat block | Various | ||
| Hybridization oven or incubator with rotator | Various | ||
| Nutator | Various | ||
| A1RSi laser scanning confoal | Nikon | 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables etc. | |||
| 50 mL conical tubes | Various | ||
| 15 mL conical tubes | Various | ||
| 1.5 mL microfuge tubes | Various | ||
| 500 µl microfuge tubes | Various | ||
| 200 µl PCR tubes | Various | ||
| Plastic container with tight fitting lid | Various | To hold Drierite | |
| Kimwipes | Various | disposable wipes | |
| Parafilm | Various | paraffin film | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other | |||
| HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | Version 6.3 |
References
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