Con fluorescencia In Situ hibridación (pescado) para supervisar el estado de la cohesión de brazo en Prometafase y metafase I ovocitos de Drosophila
Summary
Este manuscrito presenta un detallado método para la generación X-cromosoma brazo sondas y rendimiento en situ hibridación de la fluorescencia (pescado) para examinar el estado de la hermana cohesión de cromátidas hermanas en Prometafase y metafase detenido Drosophila ovocitos. Este protocolo es adecuado para determinar si cohesión brazo meiótica es intacta o interrumpida en diferentes genotipos.
Abstract
En los seres humanos, errores de la segregación del cromosoma en ovocitos son responsables de la mayoría de los abortos espontáneos y defectos de nacimiento. Por otra parte, como la edad de las mujeres, el riesgo de concebir que un feto aneuploide aumenta considerablemente y este fenómeno se conoce como el efecto de la edad materna. Un requisito para la segregación del cromosoma exacta durante las divisiones meióticas es mantenimiento de hermana cohesión de cromátidas hermanas durante el período de profase prolongada experimentan de ovocitos. Pruebas citológicas en los seres humanos y organismos modelo sugieren que la cohesión meiótica se deteriora durante el proceso de envejecimiento. Además, errores de segregación en ovocitos humanos son más frecuentes durante la meiosis I, consistente con la prematura pérdida de cohesión del brazo. El uso de organismos modelo es fundamental para desentrañar los mecanismos que subyacen a la pérdida depende de la edad de la cohesión. Drosophila melanogaster ofrece varias ventajas para el estudio de la regulación de la cohesión meiótica de ovocitos. Sin embargo, hasta hace poco, sólo las pruebas genéticas estaban disponibles para análisis por pérdida de cohesión de brazo en ovocitos de diferentes genotipos o bajo diferentes condiciones experimentales. Aquí, un protocolo detallado es siempre para usar fluorescencia en situ hibridación (FISH) para visualizar directamente defectos cohesión brazo en Prometafase y metafase arresté a ovocitos de Drosophila . Generando una sonda de pescado que cruza por hibridación en el brazo distal del cromosoma X y recolectando pilas Z confocales, un investigador puede visualizar el número de señales individuales de peces en tres dimensiones y determinar si la hermana chromatid brazos son separados. El procedimiento descrito permite cuantificar defectos de cohesión brazo de cientos de ovocitos de Drosophila . Como tal, este método proporciona una herramienta importante para la investigación de los mecanismos que contribuyen al mantenimiento de la cohesión, así como los factores que conducen a su desaparición durante el proceso de envejecimiento.
Introduction
Adecuada segregación de los cromosomas durante la mitosis y la meiosis requiere que hermana cohesión de cromátidas hermanas establecido, mantenido y liberado en una coordinada1,2. Cohesión se establece durante la fase S y es mediada por la cohesin complejo, que forma vínculos físicos que sostienen la hermana chromatids juntos. En la meiosis, cohesión distal a un crossover también funciona para unir homólogos recombinantes y esta asociación física ayuda a asegurar la orientación correcta del bivalente en la metafase del huso (figura 1)3,4, 5. Liberación del brazo de cohesión en el anaphase permite los homólogos segregar a los polos opuestos del huso. Sin embargo, si la cohesión del brazo es perdido prematuramente, recombinantes homólogos perderá su conexión física y segregan al azar, que puede dar lugar a gametos aneuploides (figura 1).
En ovocitos humanos, errores en la segregación cromosómica están la causa principal de abortos espontáneos y defectos de nacimiento, como síndrome de Down6, y su incidencia aumenta exponencialmente con la edad materna7. Cohesión de cromátidas se estableció en ovocitos fetales y la recombinación meiótica se completa antes del nacimiento. Ovocitos luego arrestar en mitad de la profase I hasta la ovulación y durante esta detención, la asociación física continua de homólogos recombinantes depende de la cohesión de cromátidas hermanas hermana. Por lo tanto, exacta segregación durante meiosis y los resultados del embarazo normal requiere que cohesión permanecen intactas hasta cinco décadas.
Pérdida prematura de cohesión durante el prolongado arresto meiótico de ovocitos humanos se ha propuesto contribuir al efecto de la edad materna y múltiples líneas de evidencia apoyan esta hipótesis8,9. Sin embargo, dado los desafíos de estudiar cohesión meiótico de ovocitos humanos, gran parte de nuestra comprensión de este fenómeno se basa en el uso del modelo organismos5,10,11,12, 1314,de,15.
Drosophila melanogaster ovocitos ofrecen numerosas ventajas para el estudio de la segregación meiótica de cohesión y cromosoma. Un simple análisis genético permite recuperar progenie de gametos aneuploides y medir la fidelidad de los X-la segregación cromosómica en una gran escala11,16,17. Por otra parte, uno puede determinar también si errores de segregación del cromosoma ocurren porque missegregate recombinantes homólogos durante la meiosis I, un fenotipo que es consistente con la prematura pérdida de brazo cohesión11,18, 19. observación del estado de cohesión meiótica de ovocitos de Drosophila también es posible usar en situ hibridación de la fluorescencia (pescado) directamente. Aunque fluorescentes oligonucleótidos que hibridan a secuencias repetitivas satélite han utilizado por más de una década para controlar pericentromeric cohesión en maduro Drosophila ovocitos4,20, análisis del brazo cohesión ha sido mucho más difícil. Visualización del estado de la cohesión del brazo requiere una sonda que abarca una extensa región de copia solo secuencias y es lo suficientemente brillante para dar lugar a señales visibles para cada hermana cromátides cuando existe cohesión de brazo. Además, las condiciones de fijación ovocitos y tamaño de los DNAs marcados deben facilitar penetración21 dentro del óvulo maduro grande de Drosophila (200 μm ancho por 500 μm de largo). Recientemente, un sondeo de brazo fue exitosamente utilizados visualizar Drosophila cromátides de ovocitos durante la anafase I, pero los autores indicó que no pudo detectar una señal en Prometafase o metafase detenido ovocitos22. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la generación de X-cromosoma brazo sondas de FISH y las condiciones de preparación de ovocitos que nos han permitido analizar por la prematura pérdida de hermana cohesión de cromátidas hermanas en Prometafase y metafase I ovocitos. Estas técnicas, que nos han permitido identificar productos génicos que se requieren para el mantenimiento de la cohesión meiótica, permitirá a otros análisis para hermana cohesión de cromátidas hermanas defectos en ovocitos maduros de Drosophila de diferentes genotipos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso de peces las puntas de prueba para evaluar el estado de la cohesión de brazo en Prometafase y metafase I Drosophila ovocitos es un avance importante en el campo de la Drosophila meiosis. Históricamente, los investigadores de Drosophila se han limitado a pruebas genéticas para deducir la pérdida prematura de la cohesión de brazo en ovocitos maduros11,18,19. Ahora, con los métodos presentado…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los NIH Grant GM59354 a Sharon E. Bickel. Agradecemos Huy Nguyen p. asistencia en el desarrollo del protocolo para la generación de sondas fluorescentes brazo, Ann Lavanway ayuda con microscopía confocal y J. Emiliano Reed para asistencia técnica. También agradecemos a numerosos colegas de la comunidad de Drosophila para discusiones útiles y consejos.
Materials
| Kits | |||
| Midi Prep kit | Qiagen | 12143 | Prep BAC clone DNA |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2 | Amplify BAC clone DNA |
| ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit | Invitrogen | A21676 | Label BAC clone DNA |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals & Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | Prepare 10% stock Freeze aliquots |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C75-500 | |
| DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use. |
| Dextran sulfate | Sigma | D-8906 | |
| Drierite | Drierite Company | 23001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 15508-013 | Prepare 10 mM stock |
| dTTP (10 µmol, 100 µl) | Boehringer Mannheim | 1277049 | Prepare 1 mM stock |
| EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) | Fisher Scientific | S311-500 | Prepare 250 mM stock |
| 100% ethanol (molecular grade, 200 proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Tris (Ultra Pure) | Invitrogen | 15504-020 | |
| EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) | Sigma | E-3889 | |
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | Toxic: wear appropriate protection |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | Toxic: wear appropriate protection |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Glycogen | Roche | 901393 | |
| HEPES | Boehringer Mannheim | 737-151 | |
| Heptane | Fisher Scientific | H350-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydrochloric acid | Millipore | HX0603-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydroxylamine | Sigma | 438227 | Prepare 3 M stock |
| 4.9 M Magnesium chloride | Sigma | 104-20 | |
| Na2HPO4 Ÿ 7H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaH2PO4 Ÿ 2H2O | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Poly-L-lysine (0.1mg/ml) | Sigma | P8920-100 | |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
| Sodium acetate | Fisher Scientific | S209-500 | Prepare 3M stock |
| Sodium cacodylate | Polysciences, Inc. | 1131 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Sodium chloride |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| 10% Tween 20 | Thermo Scientific | 28320 | Surfact-Amps |
| 10% Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | Surfact-Amps |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0 | ||
| 20X SSC (Saline Sodium Citrate) | 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate | ||
| 2X cacodylate fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA | ||
| 1.1X Hybridization buffer | 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate | ||
| Fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution | ||
| PBSBTx | 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100 | ||
| PBSTx | 1X PBS, 1% Trition X-100 | ||
| Extraction buffer (PBSTx + Rnase) | 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase | ||
| 2X SSCT | 2X SSC, 0.1% Tween 20 | ||
| 2X SSCT + 20% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide | ||
| 2X SSCT + 40% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide | ||
| 2X SSCT + 50% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| AluI | New England Biolabs | R0137S | |
| HaeIII | New England Biolabs | R0108S | |
| MseI | New England Biolabs | R0525S | |
| MspI | New England Biolabs | R0106S | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167S | |
| BfuCI | New England Biolabs | R0636S | |
| 100X BSA | New England Biolabs | Comes with NEB enzymes | |
| 10X NEB buffer #2 | New England Biolabs | Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes | |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl | Roche/Sigma | 3333566001 | |
| TdT buffer | Roche/Sigma | Comes with TdT enzyme | |
| Cobalt chloride | Roche/Sigma | Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme | |
| RNase A (10 mg/mL) | Thermo-Scientific | EN0531 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytology Tools etc. | |||
| Forceps | Dumont | #5 INOX, Biologie | |
| 9” Disposable glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | Autoclave to sterilize |
| Shallow glass dissecting dish | Custom made | ||
| Deep well dish (3 wells) | Pyrex | 7223-34 | |
| Fisherfinest Premium microscope slides | Fisher Scientific | 22-038-104 | Used to cover deep well dishes |
| Frosted glass slides, 25 x 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick | Thermo-Scientific | 3051 | |
| Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 | Thermo-Scientific | 3405 | |
| Tungsten needle | homemade | ||
| Prolong GOLD mounting media | Molecular Probes | P36930 | |
| Compressed-air in can | Various | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Various | ||
| Nanodrop 2000, spectrophotometer | Thermo-Scientific | microvolume spectrophotometer | |
| Vortexer | Various | ||
| Table top microfuge at room temperature | Various | ||
| Table top microfuge at 4 °C | Various | ||
| Heat block | Various | ||
| Hybridization oven or incubator with rotator | Various | ||
| Nutator | Various | ||
| A1RSi laser scanning confoal | Nikon | 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables etc. | |||
| 50 mL conical tubes | Various | ||
| 15 mL conical tubes | Various | ||
| 1.5 mL microfuge tubes | Various | ||
| 500 µl microfuge tubes | Various | ||
| 200 µl PCR tubes | Various | ||
| Plastic container with tight fitting lid | Various | To hold Drierite | |
| Kimwipes | Various | disposable wipes | |
| Parafilm | Various | paraffin film | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other | |||
| HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | Version 6.3 |
References
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